不同种类果汁中脂环酸芽孢杆菌及其代谢产物污染调查

白 淼张 灿*安代志张明露史 云郑文杰刘 洵

(1.军事医学科学院疾病预防控制所,北京 100071;2.北京工商大学食品学院,北京 100048;3.天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津 300456)

不同种类果汁中脂环酸芽孢杆菌及其代谢产物污染调查

白 淼,张 灿1,*,安代志1,张明露2,史 云1,郑文杰3,刘 洵2

(1.军事医学科学院疾病预防控制所,北京 100071;2.北京工商大学食品学院,北京 100048;3.天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津 300456)

为了解不同种类果汁中脂环酸芽孢杆菌及其主要代谢产物的污染情况,随机选取6种市售果汁(共24份)进行调查。采用固相微萃取(SPME)和气相色谱(GC)-质谱(MS)技术检测果汁中愈创木酚和2,6-二溴苯酚的含量,并利用YSG培养基(pH=3.7)分离果汁中的脂环酸芽孢杆菌。在24份果汁样品中,2,6-二溴苯酚检出率为0%(0/24);愈创木酚检出率为33.3%(8/24),浓度最高可达26.9 μg/L;脂环酸芽孢杆菌检出率为12.5%(3/24),分离出的3株脂环酸芽孢杆菌均来自愈创木酚含量较高的橙汁样品;在未检出愈创木酚的16份果汁样品中均没有分离出脂环酸芽孢杆菌。在所检测的24份果汁样品中,部分橙汁、葡萄汁以及桃汁中检测到愈创木酚,但是只在橙汁样品中分离出了脂环酸芽孢杆菌,表明橙汁可能更容易在生产过程中被脂环酸芽孢杆菌及其代谢产物所污染。

脂环酸芽孢杆菌,固相微萃取,气相色谱-质谱,代谢产物,菌种鉴定

脂环酸芽孢杆菌主要分布在高酸的热环境、土壤以及某些水果加工产品当中,具有嗜酸耐热、产芽孢、强抗逆性等特征[1-2]。自1984年Cerny等首次从腐败苹果汁中分离出脂环酸芽孢杆菌后[3],人们又陆续从橙汁、芒果汁、番茄汁、猕猴桃汁等果汁中发现该菌[4-7]。近年来,脂环酸芽孢杆菌造成的果汁腐败事件在美国、澳大利亚、日本等地相继大规模发生,引发人们广泛关注[8]。脂环酸芽孢杆菌在果汁中生长不会产生气体,被污染的产品也无明显的胀包或酸败[9],但是其代谢产物愈创木酚和2,6-二溴苯酚在极低浓度条件下就可对果汁风味产生不良影响,甚至使果汁出现轻微沉淀[10-11]。通常条件下,受到脂环酸芽孢杆菌污染的果汁在刚出厂时很难被检测出来,大多是在投放市场后才被发现,从而给果汁生产企业带来巨大的经济损失[12]。目前,国际贸易中严格要求每10 mL浓缩果汁中脂环酸芽孢杆菌数量不得超过1个[13]。我国部分浓缩果汁中脂环酸芽孢杆菌数量严重超标,产品合格率较低,已成为当前困扰果汁生产企业的技术难题[14]。

本研究选取6种市售果汁(共24份),采用固相微萃取(SPME)和气相色谱(GC)-质谱(MS)技术检测果汁中脂环酸芽孢杆菌的主要代谢产物(愈创木酚和2,6-二溴苯酚),同时对果汁中可能存在的脂环酸芽孢杆菌进行分离,调查不同种类果汁中脂环酸芽孢杆菌及其主要代谢产物的污染情况。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

愈创木酚标准品 加拿大Toronto Research Chemicals公司,纯度为99.9%;2,6-二溴苯酚标准品 美国Supelco公司,纯度为99.9%;测序试剂BigDye terminator v3.1 美国Applied Biosystems公司;无水硫酸钠(Na2SO4) 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;BAT固体培养基 使用1 mol/L H2SO4调节pH至4.0,青岛海博生物技术有限公司;YSG液体培养基 成分为酵母提取物2.0 g/L,葡萄糖1.0 g/L,可溶性淀粉2.0 g/L,使用1 mol/L H2SO4调节pH至3.7[15];LB固体培养基 pH中性,成分为胰蛋白胨10.0 g/L,酵母提取物10.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,琼脂15.0 g/L[16];果汁样品 选取的6种(共24份)果汁均为市售常见品牌,每种品牌随机抽取的果汁样品份数均由不同的生产批次所决定,其中100%橙汁6份(品牌A、B和C,每种品牌各取2份)、100%苹果汁6份(品牌A和B,每种品牌各取3份)、100%桃汁2份(品牌A)、100%葡萄汁4份(品牌A)、100%番茄汁4份(品牌A)和7%蓝莓汁饮料2份(品牌D),以上所有果汁均为保质期内的正常产品。

Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪和30 m×0.25 mm×0.25 μm HP-5MS色谱柱 美国Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头、固相微萃取装置 美国Supelco公司;ABI PRISM 3730xl测序仪 美国Applied Biosystems公司;Lecia EM UC6超薄切片机 德国Leica公司;Hitachi H-7650型透射电镜 日本Hitachi公司;超纯水仪 美国Thermo公司;85-2数显恒温磁力搅拌器和THZ-82A水浴恒温振荡器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果汁中脂环酸芽孢杆菌主要代谢产物检测 根据前期文献[17]报道,果汁中愈创木酚和2,6-二溴苯酚采用SPME进行捕集,通过GC-MS进行定性和定量分析。配制愈创木酚和2,6-二溴苯酚混合标准使用液,二者浓度分别为0.49、0.98、1.95、3.90、7.81、31.25、62.5、125 μg/L和0.42、0.84、1.68、3.36、6.72、26.88、53.8、108 μg/L。取9 mL混合标准使用液于萃取瓶中,加入1.8 g无水硫酸钠,55 ℃萃取35 min后,进样到GC-MS进行分析,每个样品平行测定6次,绘制标准曲线。依照相同方法测定果汁样品中愈创木酚和2,6-二溴苯酚含量。GC-MS具体条件参照文献[17]。

1.2.2 脂环酸芽孢杆菌的分离与纯化 将果汁样品在80 ℃恒温水浴中热处理13 min,然后迅速冷却至室温。处理后的果汁样品以10%的比例接种到YSG液体培养基(pH=3.7),置于水浴恒温振荡器(45 ℃、200 r/min)中培养3 d进行富集。吸取1 mL培养物,涂布在BAT固体培养基(pH=4.0)表面,置于42 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。若长出可疑菌株,则对其进行纯化,在BAT固体培养基(pH=4.0)表面进行划线,置于42 ℃恒温培养箱中培养3 d。三次纯化后对可疑菌株进行初步鉴定。

1.2.3 脂环酸芽孢杆菌初步鉴定 对纯化好的可疑菌株进行革兰氏染色和芽孢染色[18],观察其基本形态特征,同时进行嗜酸耐热性检验,具体方法参照文献[19]。

透射电镜观察:取脂环酸芽孢杆菌菌液置于无菌离心管中,以6000 r/min离心10 min(离心半径为9.5 cm),弃去上清液,用无菌PBS缓冲溶液清洗3次,之后用2.5%戊二醛固定4 h。经过脱水、浸透、固化处理后,制备标本。采用Lecia EM UC6超薄切片机切片(厚50～60 nm),乙酸铀枸橼酸铅染色后在透射电镜下进行观察。

1.2.4 菌种鉴定 提取待测样品DNA,进行PCR扩增,所使用引物为16S引物27F/1492R[20]。扩增条件为:95 ℃预变性5 min后,进行95 ℃ 20 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min 30 s的循环35次,再在72 ℃下延伸10 min,于4 ℃保温,PCR完成后用1.5%的琼脂糖胶进行切胶回收,回收后进行测序。测序结果提交到GenBank中进行BLAST相似性分析,获取相似性最高的菌株信息。选取这些相关菌株的序列,通过ClustalX软件进行全序列对比,并用MEGA 5.0构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 果汁中脂环酸芽孢杆菌主要代谢产物分析

2.1.1 SPME-GC-MS方法学验证 愈创木酚和2,6-二溴苯酚混合标准溶液色谱图如图1所示。结果表明,愈创木酚在0.49～1.25×102μg/L和2,6-二溴苯酚在0.42～1.08×102μg/L浓度范围内线性关系良好,相关系数(r)分别为0.9985和0.9964。以3倍信噪比(S/N=3)计算出愈创木酚和2,6-二溴苯酚的检测限分别为0.02 μg/L和0.08 μg/L。愈创木酚(4、24、56 μg/L)和2,6-二溴苯酚(20、58、92 μg/L)在3个浓度水平下的回收率和精密度分别为82.1%～111.4%和5.2%～6.2%。

表1 果汁中脂环酸芽孢杆菌及其代谢产物检测结果

注:LOD(Limits of Detection):检出限;N.I.(Not Isolated):未分离出。

图1 愈创木酚和2,6-二溴苯酚混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of guaiacol and 2,6-dichlorophenol mixed standard solution

2.1.2 愈创木酚和2,6-二溴苯酚的检测结果 由表1可知,24份果汁样品中,2,6-二溴苯酚检出率为0%(0/24);愈创木酚检出率为33.3%(8/24)。结果表明不同种类果汁中愈创木酚含量差异较大,6份橙汁样品中有4份检出愈创木酚且含量较高,其中A、B品牌橙汁愈创木酚浓度在10.9～26.9 μg/L之间,C品牌橙汁未检出愈创木酚;2份桃汁样品中均检出愈创木酚,含量分别为7.2和9.3 μg/L;4份葡萄汁中有2份检出愈创木酚,含量分别为5.7和10.3 μg/L。苹果汁、番茄汁和蓝莓汁饮料中均未检出愈创木酚。据文献报道,果汁中脂环酸芽孢杆菌的种类和初始浓度、果汁的成分以及贮藏温度等因素均能对愈创木酚的合成产生影响[7,21-22],从而影响愈创木酚在果汁中的含量。Jensen认为果汁中愈创木酚浓度通常要比卤酚(2,6-二溴苯酚和2,6-二氯苯酚)高出近1000倍左右[23]。张江波等对脂环酸芽孢杆菌的污染能力进行评估,发现受到脂环酸芽孢杆菌污染的猕猴桃汁中仅检测出愈创木酚,并没有检测到2,6-二溴苯酚[7]。本研究中的24份果汁样品同样均未检出2,6-二溴苯酚,这与前期相关报道的结果相一致。

2.2 果汁中脂环酸芽孢杆菌的分离与鉴定

2.2.1 果汁中脂环酸芽孢杆菌的分离与初步鉴定 由于果汁样品中脂环酸芽孢杆菌的活菌数量很少,直接涂布到BAT固体培养基(pH=4.0)上难以确保能分离到,因此本研究从每个果汁样品中吸取一定量的果汁加入到酸性的YSG液体培养基(pH=3.7)中进行富集培养。在检测的24份果汁样品中,从3份橙汁样品里面分出了可疑菌株,分别记作A2、B1和B2,其中愈创木酚的含量分别为26.4、10.9和15.7 μg/L(见表1)。3株菌株的菌落呈乳白或微黄色、圆形、边缘整齐、中心突起、直径为0.5～3.0 mm,革兰氏染色为阳性,产芽孢,细胞呈杆状,以上均符合脂环酸芽孢杆菌的一般特征[24]。3株菌株经热处理后,仍有菌落生长;在LB固体培养基(pH中性)上不生长,说明3株菌株均为嗜酸耐热菌。透射电镜结果表明(图2),3株菌株的营养细胞为直或近直的杆状,菌体宽为0.35～1.1 μm、长为2～6.3 μm,产芽孢,芽孢为端生或次端生的椭圆形,有些会使营养细胞膨大,均与脂环酸芽孢杆菌一般形态特征一致[24]。

图2 透射电镜(15000×)Fig.2 TEM images of three isolated strains(15000×)注:a为分离菌株A2;b为分离菌株B1;c为分离菌株B2。

2.2.2 菌种鉴定结果及污染情况分析 对3株分离菌株的DNA进行PCR扩增,将测序结果提交到GenBank中进行BLAST相似性分析,然后将所测得的序列与已知的脂环酸芽孢杆菌菌属不同种的全序列进行比对,整理得到系统发育树如图3所示。菌株A2与AlicyclobacillusacidocaldariusAB059672的相似性为98%,菌株B1和B2与AlicyclobacillusacidocaldariusAB059663的相似性为99%,说明分离菌株A2、B1和B2均属于Alicyclobacillusspp.。

图3 基于Alicyclobacillus相关菌种及分离所得菌种16S rDNA序列构建系统发育树Fig.3 Construction of the phylogenetic tree based on the sequences of 16S rDNA of the isolated strains and Alicyclobacillus

所检测的24份果汁样品中共分出3株脂环酸芽孢杆菌,检出率12.5%(3/24)。3份阳性样品均为橙汁,其中愈创木酚的含量分别为26.4、15.7和10.9 μg/L。部分葡萄汁和桃汁中虽然也检测到了愈创木酚,但是并未发现脂环酸芽孢杆菌。未检出愈创木酚的16份果汁样品中均未分离出脂环酸芽孢杆菌。从果汁种类上来看,橙汁与其它5种果汁(苹果汁、桃汁、葡萄汁、番茄汁和蓝莓汁饮料)相比,更容易在生产过程中被脂环酸芽孢杆菌及其代谢产物所污染。橙汁较其它几种果汁而言pH较低且营养成分丰富,其中的主要营养成分如柠檬酸、蔗糖、矿质元素(钙、镁和钾元素)等在一定浓度范围内均可促进脂环酸芽孢杆菌的生长[25]。Parish报道,佛罗里达州有超过三分之一(591/1575)的橙汁样品受到脂环酸芽孢杆菌的污染[26]。因此,橙汁生产企业更应从原料挑选、加工过程及灭菌技术等生产环节上进行更严格的监督与控制,降低产品被脂环酸芽孢杆菌污染的风险。

所检测的24份果汁样品中,脂环酸芽孢杆菌的检出率为12.5%(3/24),其主要代谢产物愈创木酚和2,6-二溴苯酚的检出率分别为33.3%(8/24)和0%(0/24)。其中,愈创木酚的检出率(33.3%)要高于脂环酸芽孢杆菌的检出率(12.5%),这可能是由于果汁在生产过程中曾遭受过脂环酸芽孢杆菌的污染,然而脂环酸芽孢杆菌却在后续的加工生产以及运输储藏等环节中失活,但是仍然可以检测出残留在果汁样品中的愈创木酚。

3 结论

本研究采用SPME-GC-MS分析果汁中脂环酸芽孢杆菌的主要代谢产物(愈创木酚和2,6-二溴苯酚),同时对果汁中可能存在的脂环酸芽孢杆菌进行分离。结果表明,所检测的24份果汁样品中共分出3株脂环酸芽孢杆菌,检出率12.5%(3/24),2,6-二溴苯酚检出率为0%(0/24),愈创木酚检出率为33.3%(8/24)。其中,所检测的6份橙汁中有4份检出含量较高的愈创木酚,浓度在10.9～26.9 μg/L之间,分离出的3株脂环酸芽孢杆菌全部来自这4份愈创木酚含量较高的橙汁样品。在未检出愈创木酚的果汁样品中均未分离到脂环酸芽孢杆菌。在所检测的24份样品中,部分橙汁、葡萄汁和桃汁也检测到愈创木酚,但是并未分离到脂环酸芽孢杆菌,只在橙汁样品中分离出该菌,表明橙汁可能更容易在生产过程中被脂环酸芽孢杆菌及其代谢产物所污染。果汁生产企业应加强日常监管,采取相应措施,有效控制生产过程中的脂环酸芽孢杆菌,避免产品受到污染。

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A survey ofAlicyclobacillusand its metabolite product spoilage in various juice

BAI Miao1,ZHANG Can1,*,AN Dai-zhi1,ZHANG Ming-lu2,SHI Yun1,ZHENG Wen-jie3,LIU Xun2

(1.Institute of Disease Control and Prevention,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China; 2.School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 3.Plant & Foodstuffs Inspection Center,Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300456,China)

To investigate the pollution ofAlicyclobacillusand its major metabolite in different types of fruit juices,six types of commercial juice products(24 samples)were examined in this study. The concentration of guaiacol and 2,6-dibromophenol in these juice were detected using solid phase microextraction(SPME)and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),and theAlicyclobacillusin juice were isolated by using acidified YSG medium(pH=3.7). The results showed that the detectable rate of 2,6-dibromophenol was 0%(0/24),the detectable rate of guaiacol was 33.3%(8/24)and the highest concentration of guaiacol reached 26.9 μg/L. Positive rate ofAlicyclobacillusin these 24 juice products arrived at 12.5%(3/24). ThreeAlicyclobacillusstrains were isolated from the orange juice products with high concentration of guaiacol contamination. The 16 juice samples which guaiacol concentration below the limits of detection,have no identication ofAlicyclobacillus. Guaiacol contamination were detected in part of the orange juice,grape juice and peach juice samples,and theAlicyclobacilluswere isolated only in orange juice. The orange juice might be contaminated byAlicyclobacillusand its major metabolite.

Alicyclobacillus;solid phase microextraction(spme);gas chromatography-mass spectrometry(gc-ms);metabolic product;strains identification

2016-04-11

白淼(1990-)，女，本科，实验员，主要从事环境微生物学研究，E-mail：baimiaobtbu@163.com。

*通讯作者:张灿(1975-)，博士，助理研究员，E-mail：zhangcancqu@163.com。

国家公益性行业科研专项-质检(201310146)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000