发酵鹅肝肽的分离纯化及其抗氧化特性研究

舒沿沿,胡冰雪,潘道东,曾小群,孙杨赢,吴 振,曹锦轩

(宁波大学食品科学与工程系,浙江宁波 315211)

发酵鹅肝肽的分离纯化及其抗氧化特性研究

舒沿沿,胡冰雪,潘道东*,曾小群,孙杨赢,吴 振,曹锦轩

(宁波大学食品科学与工程系,浙江宁波 315211)

为了提高普通鹅肝的综合利用价值,本研究利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)混合发酵制备鹅肝肽,采用Sephadex G-25凝胶层析法分离纯化出发酵鹅肝肽,并对其分离组分进行氨基酸分析和功能特性研究(抗氧化活性、金属螯合率测定),最后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)测定高活性组分的相对分子质量。结果表明:Sephadex G-25凝胶层析依次出现P1、P2、P3三个峰;其中P3的必需氨基酸含量(70.32±5.35) mg/100 g明显高于P1(40.06±2.04) mg/100 g和P2(55.39±2.56) mg/100 g,含硫氨基酸(Met、Cys)和疏水性氨基酸(Val、Ile、Leu、Phe、Ala)分别占总氨基酸含量的17.78%和31.31%,均高于P1(8.18%,21.46%)、P2(6.63%,21.53%)。P1、P2、P3均具有较强的抗氧化能力。其中P3的TBRAS值为0.2495±0.016显著低于P1、P2(p<0.01),抑制羟自由基能力,Fe2+螯合率和Cu2+螯合率分别为75.75%±0.49%、72.40%±0.80%和69.04%±0.40%,均显著高于P1、P2(p<0.01,p<0.05,p<0.05);基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定P3的相对分子质量范围在1.02 kD 以下。

发酵鹅肝肽,分离纯化,抗氧化活性,金属离子螯合活性

我国鹅肝资源丰富,但利用价值较低[1]。目前对鹅肝的利用仍限于初加工产品,研究多集中在鹅肝酱的研制,而对其精深加工研究鲜有报道。普通鹅肝的腥、异味重,质地粗糙,浆液松散,不被消费者推崇[2],但其蛋白含量高,具有潜在的利用价值。大分子蛋白结构复杂、抗原性强且不易被机体直接吸收等原因影响其利用率[3-4]。小分子多肽,不仅易消化吸收,还具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老以及调节免疫等功能[5-8]。微生物发酵法除可降解大分子蛋白,增强发酵制品的营养和风味特性外,还有助于生物活性肽的释放[9-10]。

分离纯化生物活性肽对其后期功能特性评价和结构分析,进而确定其构效关系尤为重要。凝胶色谱法除层析柱可反复使用外,还具有设备简单,操作方便,洗脱条件温和等优势,因此多用于生物活性肽的分离纯化。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)具有高的灵敏度、准确度、分辨率,是一种强有力的分析测试手段。由于其属于软电离技术,适用于大范围分子质量样品的分析[11]。这些分析特点为本实验选用 5800 MALDI-TOF测定发酵鹅肝肽的相对分子质量提供了强有力的技术支撑。

生物活性肽种类多样,其所具有的生物活性,如抗氧化、降血压等逐渐被人们所认识。自由基氧化性较强,与许多疾病和衰老有关,如关节炎、糖尿病等[12]。另一方面,活性肽与金属离子以配位键结合形成一种稳定性适中的螯合物,具有比原肽较强的抗氧化[13]、抗菌[14]、抗衰老[15]等生物活性,作为一种天然的新型功能性物质,其安全性更高,具有较好的研究价值。所以,探究发酵鹅肝肽的抗氧化等功能特性,对鹅肝蛋白源食品添加剂或功能性食品的开发意义重大。

鉴于此,本文利用产蛋白酶丰富的有益菌,混合发酵鹅肝泥,采用凝胶层析分离发酵鹅肝肽,并对其分离组分的抗氧化活性等进行评价,进而筛选出抗氧化活性较高组分,并测定其相对分子质量。此研究为鹅肝源功能性食品的开发奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冻藏鹅肝 由象山曙海大白鹅食品有限公司提供;解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliquefaciensCICC 10888)、地衣芽孢杆菌(BacilluslicheniformisCICC 21737) 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心;嗜酸乳杆菌(LactobacillusacidophilusATCC 14917) 为本实验室保存;LB培养基、MRS培养基 杭州生物试剂公司;交联葡聚糖凝胶Sephadex G-25 西安沃尔森生物科技有限公司;菲啰嗪 上海晶纯生化科技股份有限公司;抗坏血酸 成都市科龙化工试剂厂;丙二醛(Malondialdehyde)试剂盒 南京建成生物工程有限公司;抑制羟自由基能力试剂盒 南京建成生物工程有限公司;肉桂酸(CHCA C2020-10G) 美国 Sigma 公司。

A200氨基酸自动分析仪 德国安米诺西斯;5800串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF) 上海生工;立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;MM12B型绞肉机 广东省韶关市大金食品机械厂;H1850R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;Spectar Max 190 酶标仪 美国Molecular Devices公司;GYB30-6D高压均质机 上海东华高压均质机厂;YC-2层析柜 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵鹅肝肽的制备 用绞肉机将解冻鹅肝2.0 kg绞成泥状,加入1.5倍体积比的丙酮浸提24 h,8000 r/min离心20 min后倾去上清液,收集沉淀冷冻干燥48 h。将冻干后的鹅肝粉按1∶3料水比(121 ℃灭菌15 min),1∶1∶1(解淀粉芽孢杆菌:地衣芽孢杆菌:嗜酸乳杆菌)的混菌比,4%的接种量32 ℃发酵48 h,121 ℃灭菌15 min终止发酵。发酵液8000 r/min离心15 min后收集上清液,经0.08 MPa隔膜真空泵抽滤除杂、0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后,冷冻干燥成粉末状备用(0.167 kg,得率8.35%)。

1.2.2 发酵鹅肝肽的分离纯化 Sephadex G-25层析分离纯化得到不同分子量大小的鹅肝肽,流动相用脱气后的超纯水,以10 mL/min的流速在220 nm波长处检测。上样质量浓度为2.0 mg/mL,上样量0.75 mL/(mL葡聚糖凝胶)。收集峰的洗脱液,冷冻干燥后收集备用。

1.2.3 发酵鹅肝肽氨基酸含量组成分析 称取50 mg分离纯化后冻干的发酵鹅肝肽,加入5 mL 6 mol/L HCl,混匀,吹入氮气待空气排净后封口。在烘箱内110 ℃消化24 h后,用超纯水定容至50 mL容量瓶中,混匀后取1 mL移入玻璃瓶中旋转蒸发至无流动水,再用1 mL 0.02 mol/L的HCl溶解,摇匀后用0.22 μm水系过滤器过滤,收集至样品瓶中用氨基酸分析仪检测。

1.2.4 发酵鹅肝肽的抗氧化特性研究

1.2.4.1 抗脂质氧化能力测定 抗脂质氧化能力测定方法参考[16]略有改动,取1.0 g玉米油,100 μL吐温-20,100 mL蒸馏水加入烧杯混匀,在冰盒内放置30 min后,均质2 min制成水包油型乳化剂。取8 mL上述乳化剂、0.5 mL 0.2%的抗坏血酸、0.5 mL 200 ppm的Fe2+(FeSO4)和1 mL样品(5 g/L)混匀后37 ℃孵育16 h。孵育结束后按丙二醛(MDA)试剂盒法依次加入试剂,涡旋,用封口膜封口并刺孔,95 ℃水浴40 min,取出后冰浴10 min,离心(4000 r/min)10 min,取上清在532 nm处测吸光值。硫代巴比妥酸(TBARS)值用每mL乳化剂中生成丙二醛的nmol数表示。

式(1)

式中,10为标准品浓度,单位为nmol/L。

1.2.4.2 抑制羟自由基能力测定 羟自由基是活性氧的一种,主要由过氧化物负离子和过氧化氢反应生成,可使组织遭受氧化性损伤和破坏。抑制羟自由基能力测定严格按照试剂盒说明书进行。

羟自由基抑制率(%)=对照OD值-测定OD值/对照OD值×100

式(2)

1.2.4.3 Fe2+螯合活性测定[17]依次加入100 μL样品(5 g/L)、1 mL蒸馏水和1 mL 10 ppm Fe2+(FeSO4)于10 mL离心管中,混匀后室温孵育5 min,接着用900 μL 11.3%的TCA除去大蛋白,4000 r/min离心10 min后取1 mL上清液移入10 mL离心管,再依次加入1 mL蒸馏水,800 μL 10%的乙酸铵,200 μL邻二氮菲亚铁离子颜色指示剂,涡旋后孵育5 min,562 nm测吸光值,根据公式(2)计算Fe2+螯合率。

表1 发酵鹅肝肽的氨基酸组成及含量(mg/100 g)

式(3)

1.2.4.4 Cu2+螯合活性测定[18]依次加入1 mL 2 mM CuSO4,1 mL 10%的吡啶,20 μL 0.1%的邻苯二酚紫和1 mL样品(5 g/L)于10 mL离心管中,混匀后室温孵育5 min,在632 nm测吸光度,根据公式(3)计算Cu2+螯合率。

式(4)

1.2.5 飞行时间质谱对P3的相对分子质量分析 取1 μL P3样品点至样品靶上,自然干燥后,再取0.6 μL CHCA 基质溶液点至对应靶位上并自然干燥,用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品,在正离子模式下选择线性方法对样品测试范围进行校准测试,标准物质校准范围为:1.05、1.53、2.47、3.49 kD。校准后在正离子模式下选择线性方法测试样品分子量。最后将质谱数据及图谱进行处理,5800 MALDI-TOF/TOF产生的原始数据及图谱由4000 Series Explorer V3.5软件导出。

1.3 数据统计与分析

每个处理均做三个重复,数据以平均值±标准差表示,所得数据使用SAS 8.0中one-way ANOVA的 Duncan’s Multiple Range Test 模型进行统计学分析,差异显著性水平p<0.05。

2 结果与讨论

2.1 Sephadex G-25层析分离纯化鹅肝肽

凝胶层析是一种能将不同分子量大小物质分离的层析方法。其原理是:大分子只留在凝胶颗粒之间的流动相中,因此率先流出层析柱,而小分子则能自由出入凝胶颗粒中,并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡,因此需较长的时间流出柱床,从而使不同大小分子量的物质得以分离。

由图1可看出,整个层析过程中先后出现了3个明显的峰P1、P2、P3。由此可看出SephadexG-25层析可将发酵鹅肝肽按分子量大小分离出三个组分,且分子量大小P1>P2>P3。

图1 发酵鹅肝肽的Sephadex G-25层析图Fig.1 Sephadex G-25 chromatography of peptides from fermented goose liver

2.2 发酵鹅肝肽氨基酸组成及含量

小分子肽的功能特性不仅与其相对分子质量有关,还与其氨基酸含量、种类密切相关。由表1可知,P1、P2、P3均含有16种氨基酸,其中P3的必需氨基酸含量(70.32±5.35) mg/100 g明显高于P1(40.06±2.04) mg/100 g、P2(55.39±2.56) mg/100 g。研究表明含硫氨基酸和疏水性氨基酸具有抗氧化活性[19-20],P3中含硫氨基酸(Met、Cys)含量和疏水性氨基酸(Val、Ile、Leu、Phe、Ala)含量分别占总氨基酸含量的17.78%和31.31%,均高于P1(8.18%,21.46%)、P2(6.63%,21.53%),这表明P3具有潜在的抗氧化活性。

2.3 发酵鹅肝肽体外抗氧化特性

2.3.1 发酵鹅肝肽的抗脂质过氧化能力测定 丙二醛是脂质过氧化最重要的产物之一,所以丙二醛含量越少,抗氧化活性越高。由图2可知,抗脂质过氧化能力测定实验样品组P1、P2、P3的TBARS值均低于对照组,分别为0.605±0.013,0.305±0.032,0.2495±0.016,其中,P1的TBARS值约是对照组的70%,P2的TBARS值约是对照组的35%,P3的TBARS值约是对照组的28%,与 Abeyrathne[16]研究中添加卵黏蛋白酶解物组的TBARS值是对照组的33.30%的结果接近,均具有较高的抗脂质氧化活性。

图2 发酵鹅肝肽的抗脂质过氧化能力Fig.2 Lipid peroxidation inhibition capacities of peptides from fermented goose liver 注:P1:G-25 P1收集液,P2:G-25 P2收集液,P3:G-25 P3收集液,Control:对照组;a、b、c、d不同字母代表差异显著,p<0.05或p<0.01,图2～图5同。

2.3.2 发酵鹅肝肽抑制羟基自由基能力测定 由图3可知,样品组P1、P2、P3均具有较强的抑制羟基自由基能力,分别为45.73%±0.46%,55.20%±0.84%,75.75%±0.49%。其中,P3的羟自由基清除率略高于曾庆祝[21]扇贝边枯草杆菌酶解产物中分子量为1.8 kD的肽(64.3%),与邱春江[22]贻贝酶解产物中1.4 kD的肽(76.15%,69.13%)相当。

图3 发酵鹅肝肽的抑制羟自由基能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ratios of peptides from fermented goose liver

2.3.3 发酵鹅肝肽的Fe2+螯合活性测定 由图4可知,Fe2+螯合活性测定实验样品组P1、P2、P3均有较高的Fe2+螯合活性分别为49.85%±0.75%,60.86%±0.44%,72.40%±0.80%,其中P3活性高于Abeyrathne[16]研究中卵黏蛋白酶解产物、黄鳝鱼骨多肽[23]。由于具有高Fe2+螯合率的肽具有更强的抗氧化能力[24],所以,研究具有高Fe2+螯合率的发酵鹅肝肽有助于其抗氧化活性的研究。

图4 发酵鹅肝肽的Fe2+螯合活性Fig.4 Fe2+ chelating activity of peptides from fermented goose liver

2.3.4 发酵鹅肝肽的Cu2+螯合活性测定 由图5可知,Cu2+-螯合活性测定实验样品组P1、P2、P3均具有较好的Cu2+螯合活性,分别是44.80%±0.9%,50.91%±0.97%,69.04%±0.40%,均高于马铃薯水解肽(43.0%)[25]。

图5 发酵鹅肝肽的Cu2+螯合活性Fig.5 Cu2+ chelating activity of peptides from fermented goose liver

2.4 功能特性较高组分P3的相对分子质量分析

发酵鹅肝肽体外抗氧化特性研究表明,由Sephadex G-25层析分离纯化得到的三组分中,P3组分抗氧化活性相对最佳,有必要对其进行更深一步的鉴定。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱目前多用于生物大分子检测、微生物筛选鉴别、蛋白和多肽等物质鉴定等。如Zhao等[26]用MALDI-TOF-MS测定了植物乳杆菌素JLA-9的分子质量为1.04 kD;Agrawal等[27]利用MALDI-TOF-MS鉴定了珍珠粟水解物中抗氧化肽的氨基酸序列;由图6可知MALDI-TOF鉴定P3的分子质量范围在1.02 kD以下,与苜蓿叶蛋白水解物[28]中抗氧化肽分子量小于1.0 kD结果一致。对于发酵鹅肝抗氧化肽肽段结构的鉴定以及构效关系研究还需要对其进一步纯化并做相应的细胞或动物实验。

图6 P3相对分子质量分析结果Fig.6 Molecular weight analysis of P3

3 结论

水解动植物蛋白制备生物活性肽是近年来研究的热点,以农副产品如玉米蛋白粉、大豆蛋白等为原料制备生物活性肽的研究较多。近年来陆续出现以动物下脚料如胎盘[29]、鱼鳞胶原蛋白30]等为原料制备生物活性肽。但对于鹅肝源生物活性肽的制备鲜有报道。

本研究采用微生物发酵法制备发酵鹅肝肽,经Sephadex G-25凝胶柱层析依次分离纯化出P1、P2、P3三个组分,抗氧化特性评价实验表明三者均具有较强的抗氧化活性,金属螯合活性,其中P3活性最高。此结果与2.2发酵鹅肝肽氨基酸分析结果P3相对P1、P2具有较高含量的抗氧化活性氨基酸结果一致。MALDI-TOF鉴定P3的分子质量范围在1.02 kD以下,表明分子量<1.02 kD的发酵鹅肝肽抗氧化活性最强。本实验获得了较高活性的发酵鹅肝肽,为其进一步的结构鉴定及构效关系探索奠定了研究基础。

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Isolation and antioxidant activity of fermentation peptides from goose liver

SHU Yan-yan,HU Bing-xue,PAN Dao-dong*,ZENG Xiao-qun,SUN Yang-ying,WU Zhen,CAO Jin-xuan

(Department of Food Science and Engineering,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Fermented peptides from goose liver were prepared using Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus licheniformis,and lactobacillus acidophilus. The fermented peptides were separated and purified by Sephadex G-25 gel filtration chromatography. The composition and content of amino acids were analysed by Amino Acid analyzer,and then functions(antioxidant activity and metals-chelating activity)of P1、P2、P3 were studied. The relative molecular weight of high-active fraction was determined by MALDI-TOF/TOF. Three peptide peaks were obtained after Sephadex G-25 gel filtration chromatography. The content of essential amino acid of P3(70.32±5.35)mg/100 g was significantly higher than P1(40.06±2.04)mg/100 g,and P2(55.39±2.56)mg/100 g;Proportions of sulfur-containing amino acids(Met、Cys)and hydrophobic amino acids(Val、Ile、Leu、Phe、Ala)in total amino acids of P3(17.78%,31.31%)were higher than those of P1(8.18%,21.46%)and P2(6.63%,21.53%). P1、P2 and P3 all possessed strong antioxidant activity. The TBRAS of P3(0.2495±0.016)was significantly smaller than P1、P2(p<0.01),the hydroxyl radical scavenging ratio75.75%±0.49%、Fe2+chelating activity(2.40%±0.80% and Cu2+chelating activity69.04%±0.40%was significantly higher than P1、P2(p<0.01,p<0.05,p<0.05).The relative molecular weight of P3 was determined to be lower than 1.02 kD by MALDI-TOF/TOF.

fermented peptide from goose liver;purification;antioxidant activity;metal chelating activity

2016-06-30

舒沿沿( 1989-) ，女，在读硕士，研究方向:功能性因子，E-mail:shuyanyan900707@163.com。

*通讯作者:潘道东(1964-)，男，博士，教授，研究方向:畜产品加工，E-mail:daodongpan@163.com。

水禽肉品质及其深加工技术研究(ZX2012000380)。

TS251

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000