广西壮族及汉族代谢综合征患者的脂联素水平及其基因-11377C/G和+276G/T多态性▲

黄生金 陆俊佳 朱 旭 杨 兰 郑利平

(1 广西南宁市马山县人民医院检验科，马山县 530600，E-mail：huangshengjin1964@126.com；2 广西医科大学第三附属医院暨南宁市第二人民医院检验科，南宁市 530031)

论著·临床研究

广西壮族及汉族代谢综合征患者的脂联素水平及其基因-11377C/G和+276G/T多态性▲

黄生金1陆俊佳2朱 旭2杨 兰2郑利平2

(1 广西南宁市马山县人民医院检验科，马山县 530600，E-mail：huangshengjin1964@126.com；2 广西医科大学第三附属医院暨南宁市第二人民医院检验科，南宁市 530031)

目的 分析广西壮族及汉族代谢综合征(MS)患者的脂联素水平及其基因位点+276G/T和-11377C/G的多态性。方法 壮族MS患者(壮族MS组)、壮族正常人(壮族正常组)、汉族MS患者(汉族MS组)和汉族正常人(汉族正常组)各100例，采用酶联免疫吸附试验检测血清脂联素浓度，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测脂联素基因位点的多态性。结果 (1)与同族正常组比较，两个MS组HDL-C和脂联素均显著降低(P<0.05)，而体重指数(BMI)、空腹血糖(FPG)、收缩压、舒张压、TG、TC、LDL-C明显升高(P<0.05)；两个MS组间的FPG、BMI、收缩压、舒张压、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂联素水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。(2)4组的脂联素+276和-11377基因型及等位基因分布频率符合H-W群体遗传平衡法则(P>0.05)。与同族正常组比较，壮族、汉族MS组的脂联素+276GT和TT基因频率明显升高(P<0.05)。4组的脂联素-11377位点绝大部分是野生型CC基因型，等位基因分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。(3)壮族、汉族MS组中脂联素+276位点携带 GG 型的患者血清脂联素水平显著高于基因型为GT和TT型的患者(P<0.05)。壮族、汉族MS组脂联素+276位点GT型的患者脂联素水平较TT型患者略高，但差异无统计学意义(P>0.05)。汉族MS组脂联素+276位点GG、GT、TT基因型患者的脂联素水平明显低于壮族MS组相同基因型患者(P<0.05)。两个MS组中脂联素-11377位点CC型和CG型患者的脂联素水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 广西壮族和汉族MS发生可能与脂联素+276位点T基因型导致血清中脂联素水平降低有关。脂联素+276基因位点可作为MS的筛选基因之一。

代谢综合征；脂联素；基因多态性；壮族；汉族；广西

代谢综合征(metabolic syndrome，MS)因具有多重心血管危险因素而成为研究热点之一[1-2]。脂联素具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集等生物活性，且其所在基因区域与2型糖尿病和MS的发生发展密切相关。本文旨在探讨脂联素水平及其基因位点+276G/T和-11377C/G基因多态性与MS的关系，为防治MS提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择广西南宁市(壮族主要分布区)的壮族MS患者(壮族MS组)、壮族健康人(壮族正常组)、汉族MS患者(汉族MS组)和汉族健康人(汉族正常组)各100例为研究对象。壮族MS患者：男52例，女48例，年龄46～75岁，平均年龄53.1岁；壮族健康人：男55例，女45例，年龄50～71岁，平均年龄53.9岁；汉族MS患者：男55例，女45例，年龄47～78岁，平均年龄54.3岁；汉族健康人：男53例，女47例，年龄49～72岁，平均年龄54.4岁。壮族、汉族MS患者及健康人入选标准：(1)三代中未有与其他民族通婚的壮族或汉族家族，选择第三代个体为研究对象，且尽可能确保研究对象在其可追踪的历史上没有与其他民族人通婚；(2)各个研究对象间无血缘关系；(3)无遗传性疾病家族史及其他急、慢性疾病史。MS的诊断标准参照《中国成人血脂异常防治指南》[3]。4组研究对象的年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象均对本研究知情同意，且自愿参加。

1.2 标本采集 抽取每个研究对象空腹静脉血5 ml，分别平均注入干燥管和乙二胺四乙酸抗凝管中。干燥管放置 30 min后，低速(3 000 r/min)离心10 min，取血清置于-20℃冰箱保存，用于测定空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂联素水平。乙二胺四乙酸抗凝管中的标本充分混匀，用于脂联素基因位点多态性检测。

1.3 主要仪器和试剂 日立-7600全自动生化仪(日本日立公司)，RT-6000酶标仪(深圳雷杜生命科学有限公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)。凝胶成像仪(珠海黑马生物公司)，ABI-9700扩增仪(美国ABI公司)，脂联素试剂(美国GBD公司，批号Z2013006)，DNA抽提试剂(北京天根生化科技有限公司，批号N2509)。

1.4 血清FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂联素水平的检测 采用日立-7600全自动生化仪测定FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C。脂联素采用酶联免疫吸附法，严格按照试剂说明书操作。

1.5 DNA制备 全血DNA的制备严格按照试剂说明书操作，最后置于-20℃冰箱保存备用。

1.6 脂联素+276和-11377基因位点检测

1.6.1 反应体系：PCR混合反应液8 μl(含脱氧核苷三磷酸缓冲液)、Taq酶0.5 μl、无菌水37.5 μl、DNA模版2 μl和上、下游引物各1 μl，共50 μl反应体系。脂联素+276和-11377基因位点引物序列见表1。

表1 脂联素+276和-11377基因位点引物序列

1.6.2 扩增条件：脂联素+276位点扩增条件： 94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共35个循环； 72℃延伸7 min。脂联素-11377位点扩增条件：94℃预变性5 min；94℃ 1 min，62℃ 45 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃延伸5 min。

1.6.3 限制性片段长度多态性分析：(1)脂联素+276位点：PCR产物20 μl、BsmI内切酶1 μl，缓冲液3 μl，无菌水6 μl，37℃酶切1 h。脂联素+276G/T PCR产物长度为745 bp(T等位基因)，酶切后为225 bp和520 bp的两个片段(G等位基因)。(2)脂联素-11377位点：PCR产物20 μl、AlwNI内切酶1 μl，缓冲液3 μl，无菌水6 μl，37℃酶切1 h。脂联素-11377C/G的PCR产物长度为450 bp(G等位基因)， 酶切后为95 bp和355 bp(C等位基因)两个片段。酶切后产物5 μl在2%琼脂糖凝胶上点样，电压100 V，电泳30 min后凝胶图像分析仪下观察电泳结果并摄像保存。

1.7 统计学分析 采用统计学软件SPSS 17.0进行数据处理，计量资料以(x±s)表示，采用t检验，多组间计量资料的比较采用方差分析，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。脂联素等位基因进行Hardy-Weinberg平衡检验，P>0.05即表明样本具有群体代表性。

2 结 果

2.1 4组血压、血脂、血糖及脂联素比较 4组间体重指数(body mass index，BMI)、血压、血脂、FPG及脂联素比较，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步比较，壮族MS组、汉族MS组的HDL-C和脂联素均分别低于壮族正常组、汉族正常组(P<0.05)，而BMI、FPG、收缩压、舒张压、TG、TC、LDL-C均分别明显高于壮族正常组、汉族正常组(P<0.05)。壮族MS组与汉族MS组的FPG、BMI、收缩压、舒张压、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂联素略有不同，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组血压、血脂、血糖及脂联素比较(x±s)

2.2 4组脂联素+276和-11377位点多态性 经Hardy-Weinberg平衡检验，4组的脂联素+276G/T和-11377C/G基因型和等位基因频率分布均达到遗传平衡(P>0.05)，具有群体代表性。两个民族MS组的脂联素+276位点T基因型分布频率杂合程度均较高，其中以汉族的MS组最高。脂联素-11377位点4组均以野生型(CC基因型)为主。4组脂联素+276位点基因型分布、等位基因频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，壮族MS组脂联素+276基因的GT和TT基因型分布频率明显比壮族正常组高(P<0.05)；汉族MS组的GT和TT基因型分布频率也显著高于汉族正常组(P<0.05)；壮族MS组脂联素+276基因GT基因型和TT基因型分布频率与汉族MS组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。4组间的脂联素-11377位点基因型分布、等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 4组脂联素+276和-1136177位点基因型和等位基因频率分布(n，%)

2.3 MS组脂联素+276和-11377不同基因型患者血清脂联素水平 两个MS组中脂联素+276位点不同基因型患者血清脂联素水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两个MS组中脂联素+276位点携带 GG 型的患者血清脂联素水平显著高于基因型为GT 和TT型的患者(P<0.05)。MS组脂联素+276位点GT型患者的脂联素水平较TT型的患者略高，但差异无统计学意义(P>0.05)。汉族MS组脂联素+276位点GG、GT、TT基因型患者脂联素水平明显低于壮族MS组相应基因型患者(P<0.05)。两个MS组中脂联素-11377位点CC型别和CG型别的脂联素水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 壮族、汉族MS组脂联素+276和-11377不同基因型患者血清脂联素水平比较(x±s，mg/L)

3 讨 论

近年来MS的患病率不断上升，心脑血管病的发生率和病死率也不断增加[2]。因此，早发现、早预防MS非常重要。脂联素是由脂肪组织特异性分泌的一种激素蛋白，可通过自分泌、旁分泌和内分泌方式影响葡萄糖转化、脂质代谢、血管内皮功能、炎症反应和胰岛素抵抗，与肥胖、2型糖尿病密切相关[4-5]。MS患者血清脂联素水平较正常人显著降低，脂联素被认为是MS的生物学标志。脂联素基因位于人染色体3q27区域，该区域有3个外显子和2个内含子，具有丰富的多态性[6]，也是2型糖尿病、MS、冠心病的易感基因区域[7-9]。但脂联素基因多态性存在种族和地区差异,以致国内外研究结果不一致，甚至不同地区同一种族人群也会有相互矛盾的结果[10]。

本研究发现与同民族正常人比较，壮族MS组和汉族MS组血清中脂联素水平显著降低(P<0.05)，这与Kizer等[11]的研究结果相似，提示血清低脂联素水平可能与MS的发生密切相关。目前关于脂联素内含子3第276位点G/T变异的研究结果不一致，有研究表明276位点G/T变异与肥胖个体的低脂联素水平相关[12]，而另一项研究表明该变异位点与代谢综合征不相关[2]。本文结果显示，壮族MS组和汉族MS组脂联素+276的GT、TT基因型明显高于同族正常组(P<0.05)，且T等位基因在壮族和汉族MS患者中较多见。MS组中脂联素+276位点携带 GG 型的患者血清脂联素水平显著高于基因型为GT 和TT型的患者(P<0.05)，推测携带单核苷多态性+276 T基因型的个体血清中低水平脂联素可能更易发展为MS，这与国内外研究结果[9，11]相似。提示脂联素+276是广西地区壮族和汉族MS的易感基因。本文结果显示，汉族MS组脂联素+276位点GG、GT、TT基因型患者脂联素水平明显低于壮族MS组(P<0.05)，分析原因可能与壮族MS患者的血脂、血糖和血压等均稍低于汉族患者有关。本文结果显示，两个民族MS组和正常组的脂联素-11377位点主要以野生型CC基因型为主，基因突变程度均不高；两个MS组中脂联素-11377位点CC型别和CG型别的脂联素水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示SNP-11377基因多态性与MS可能无关，不是MS的一个危险因素。这与汪琳姣等[13]在桂北地区汉族体检人群中的研究结论相似。但Lin等[14]的研究表明携带脂联素-11377 GG基因型的MS患者空腹血清胰岛素、FPG和胰岛素抵抗指数水平明显增高，而血浆脂联素水平明显降低，是MS发生的一个危险因素。我们推测，造成这种差异的原因可能有以下几点：(1)研究对象所处的环境、地区不同；(2)研究对象的种族不同，基因遗传规律存在差异；(3)本研究观察的样本量较少，研究人群代表性还不够强，具有局限性，不足以检测出相关性；(4)脂联素基因-11377C/G位点不是广西地区MS的候选基因位点。

综上所述，广西地区汉族、壮族MS患者的发生可能与脂联素+276T基因型导致血清中低脂联素水平密切相关。将脂联素+276基因位点作为MS的筛选基因之一有助于早期发现广西地区MS的易感人群。

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Adiponectin level and its polymorphisms of -11377C/G and +276G/T genotypes in patients of Zhuang and Han nationalities with metabolic syndrome from Guangxi

HUANGSheng-jin1,LUJun-jia2,ZHUXu2,YANGLan2,ZHENGLi-ping2

(1DepartmentofClinicalLaboratory,thePeople′sHospitalofMashanCounty,Nanning530600,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,
theThirdAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,theSecondPeople′sHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530031,China)

Objective To analyze the adiponectin level and the polymorphisms of adiponectin +276G/T and -11377C/G genotypes in patients of Zhuang and Han nationalities with metabolic syndrome(MS) from Guangxi.Methods The levels of serum adiponectin were detected by enzyme-linked immunosorbent assay in patients of Zhuang nationality with MS(Zhuang MS group,n=100),normal individuals of Zhuang nationality(Zhuang normal group,n=100),patients of Han nationality with MS(Han MS group,n=100) and normal individuals of Han nationality(Han normal group,n=100).And the polymorphisms of adiponectin genotypes were detected using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.Results ① Compared to the normal group of same nationality,the adiponectin and HDL-C levels significantly decreased,while the body mass index(BMI),fasting plasma glucose(FPG),systolic blood pressure(SBP),diastolic blood pressure(DBP),TC,TG and LDL-C were significantly higher in the two MS groups(P<0.05).There were no significant differences in FPG,BMI,SBP,DBP,TG,TC,HDL-C,LDL-C and adiponectin levels between the two MS groups(P>0.05).② The distribution frequencies of genotype and allele of adiponectin +276 and -11377 in the four groups were consistent with the H-W population genetic equilibrium(P>0.05).The frequencies of GT and TT of adiponectin+276 genotypes in Zhuang and Han MS groups were significantly higher than those of normal group with same nationality(P<0.05).Among the 4 groups,most of the adiponectin -11377 loci were the wild type,but there was no significant difference in the distribution of allele frequencies(P>0.05).③ In the Zhuang and Han MS groups,the serum adiponectin level of patients with adiponectin +276GG genotype was significantly higher than that of patients with GT or TT genotype(P<0.05).The adiponectin level of patients with adiponectin +276GT genotype was a little higher than that of patients with TT genotype,but no significant difference was found(P>0.05).The adiponectin levels of patients with adiponectin +276GG,GT and TT genotype in the Han MS group were significantly lower than those of patients with adiponectin +276GG,GT and TT genotype in the Zhuang MS group respectively(P<0.05).In the two MS groups,there was no significant difference in the adiponectin level between the patients with adiponectin -11377CC and CG genotype(P>0.05).Conclusion The decline of serum adiponectin level induced by T genotype of adiponectin +276 gene locus may be associated with the occurrence of MS in Guangxi Zhuang and Han nationalities.Adiponectin +276 gene locus may become one of the genes for MS screening. 【Key words】 Metabolic syndrome,Adiponectin,Gene polymorphism,Zhuang nationality,Han nationality,Guangxi

广西南宁市科学研究与技术开发计划(2012135)

黄生金(1964～)，男，本科，副主任技师，研究方向：临床医学检验。

郑利平(1965～)，女，本科，主任检验技师，研究方向：医学检验，E-mail：46805193@qq.com。

R 589

A

0253-4304(2016)06-0787-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.10

2016-01-20

2016-04-16)