中药抗耐药大肠埃希菌的机制研究进展▲

刘坤友

(广西柳江县人民医院检验科，柳江县 545100，E-mail：Ljrylky@163.com)

综 述

中药抗耐药大肠埃希菌的机制研究进展▲

刘坤友

(广西柳江县人民医院检验科，柳江县 545100，E-mail：Ljrylky@163.com)

耐药大肠埃希菌是社区和医院感染的常见致病菌之一，其耐药机制复杂多变。中药及其方剂抗耐药大肠埃希菌的机制主要有抑制超广谱β-内酰胺酶、消除R质粒、改变细菌外膜通透性、干扰细菌的代谢、提高机体免疫功能及消除炎症反应等。构建新的方剂，纯化中药的有效成分、明确其分子结构，探讨其消除耐药的机理，是今后研究的方向。

大肠埃希菌；耐药；中药；超广谱β-内酰胺酶；R质粒；细菌外膜；综述

大肠埃希菌是临床最常见的一种致病菌，常引起爆发流行，也是引起医院内感染和社区获得性感染重要病原菌之一。在近10 年的医院细菌检验标本中，大肠埃希菌标本数量历年均居前5位[1]。据2013年我国细菌耐药监测报告，在检出的致病菌中，大肠埃希菌居首位占18.3%，其耐药菌株占72.2%，且对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢呋辛、庆大霉素、氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松等一线抗生素高度耐药[2]，给临床治疗带来极大的困难。中医药治疗感染性疾病历史悠久，疗效显著，从中草药中寻找抗耐药的有效成分、研发新型抗感染药物已成为当前国内外有关研究的热点之一。本文对中药抗耐药大肠埃希菌的研究进展综述如下。

1 抑制超广谱β-内酰胺酶

大肠埃希菌耐药机制非常复杂，且变化迅速，其中产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是其重要机制之一。ESBLs因能水解β胺类抗生素(氨曲南、卡芦莫南等)而使细菌产生耐药。ESBLs的活性可以被克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等ESBLs抑制剂所抑制，因此抑制ESBLs的活性、减少其分泌量，是消除大肠埃希菌耐药的有效途径之一[3]。

近年，国内学者对中草药进行大规模研究后发现，体外具有抑菌作用的中草药繁多，主要集中在清热解毒(半枝莲、金银花、板蓝根、鱼腥草、白头翁、穿心莲、白花蛇舌草等)、清热燥湿(大黄、黄芩、黄连、黄柏、龙胆草、苦参等)、清热泻火(知母、天花粉、栀子、夏枯草等)、理气化痰(橘红、薤白、白芥子、苏子等)、活血化淤(厚朴、桃仁、川芎、川断、丹参、红花)等中药，其水提物浓度为0.1～0.8 g/ml时即对产ESBLs的大肠埃希菌有较强的抑制作用，用这些中药组成的方剂治疗感染性疾病具有较好的临床效果。双黄连粉针剂(哈药集团中药二厂)和清开灵注射液[由胆酸、珍珠母(粉)、猪去氧胆酸、栀子、水牛角(粉)、板蓝根、黄芩苷和金银花组成，神威药业有限公司]均具有广谱抗菌作用，是治疗感染性疾病的常用药物，能减轻脏器损伤，消除患者菌血症症状，缩短临床病程，提高治疗效果。雷云[4]用双黄连粉针剂、清开灵注射液处理产ESBLs的大肠埃希菌，其 ESBLs活性为(3.68±0.21)U/mg，明显低于空白对照组的(12.75±0.42)U/mg(P<0.05)，说明双黄连粉针剂、清开灵注射液抑制大肠埃希菌是通过降低ESBLs活性实现的。

三黄汤(大黄、黄连、黄芩)、黄连解毒汤(黄连、黄芩、黄柏、栀子)、五味消毒饮(金银花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子、野菊花)是治疗消化、呼吸、泌尿生殖系统急性感染性疾病的常用方药。贾云鹏等[5]用试管二倍稀释法测定3种中药方剂的最低抑菌浓度分别为0.2 g/ml、0.1 g/ml、0.3 g/ml，认为3种方剂对多重耐药的大肠埃希菌均有抑制作用，酶活性测定试验发现其能降低ESBLs活性；采用Bradford法测定菌体内蛋白质总含量，发现3 种方剂能减少ESBLs的产量的含量；三黄汤、黄连解毒汤、五味消毒饮体外抑制试验效果与ESBLs抑制剂——克拉维酸相当，但抑制ESBLs活性及减少ESBLs的含量效果却不及克拉维酸(P<0.05)，说明三黄汤、黄连解毒汤、五味消毒饮逆转细菌耐药性尚存在其他机制。目前已发现ESBLs基因型有200余种，主要为CTX-M、TEM、OXA和SHV型[6]，但三黄汤对产ESBLs大肠埃希菌的体内的ESBLs编码基因OXA有抑制作用，可使其表达量下降，而对TEM、CTX-M、SHV、Acr-AB基因无明显抑制作用[7]。

2 消除R质粒

质粒是细菌核质以外的DNA，其种类繁多，其中R质粒携带着耐药基因。R质粒可以在菌体内复制，在细胞分裂时传给子代细菌；也可以通过细菌菌毛、噬菌体等媒介在细菌间传播，从耐药菌株转移到敏感菌，使耐药性得以快速传播[8-9]。因此，通过消除耐药大肠埃希菌R 质粒，可使药物恢复敏感性。

李玉虎等[10]用木香、黄精水煎提取液与痢疾杆菌氯霉素耐药株(S.flexneRiD15 R-plasmid CmR)和大肠埃希菌氯霉素敏感株(Escherichiacoli1485 RifR)培养48 h后，两种细菌间R质粒转移率为3.5%，明显低于R质粒自然转移率63.5%(P<0.01)；R质粒转移抑制率95.9%，与消除剂——溴化乙锭的R质粒转移抑制率(95.3%)比较，差别无统计学意义(P>0.05)。说明木香、黄精能抑制CmR质粒；在S.flexneRiD15 R-plasmid CmR与Escherichiacoli1485 RifR间的接合传递，从而使质粒在细菌间的接合传递受阻，能控制细菌耐药性的产生和蔓延。

黄连、黄芩、大黄是最常用的清热、燥湿、泻下中药，由其组成的二黄汤1号(黄连+大黄)、二黄汤2号(黄芩+大黄)、三黄汤(黄芩+黄连+大黄)、三黄片(大黄+黄芩总苷+盐酸黄连素)是治疗肺炎、细菌性痢疾、腹泻等感染性疾病的常用药物，体外实验证明其水煎提取液能有效抑制大肠埃希菌的作用；通过质粒图谱比对分析，表明大肠埃希菌的耐药逆转率为11%；用碱裂解法进行质粒抽提，对大肠埃希菌耐药R质粒消除率为31%，质粒变化相关度(耐药逆转与质粒丢失之间的关系)达75%以上。说明其逆转细菌耐药性作用的机制可能与耐药质粒的消除有关，R质粒消除后可能部分改变了染色体的结构，造成染色体上耐药基因的失活或丢失等[11]。

雷云[4]采用凝胶成像仪进行检查， 发现使用双黄连及清开灵前后耐药大肠埃希菌质粒图谱中丢失一条R 质粒带，说明其可消除耐药大肠埃希菌R质粒。然而，康梅等[12]的研究表明，虽然三黄片对大肠埃希菌有非常明显的抑制作用，但质粒指纹图谱分析发现质粒谱却无改变，说明其未真正消除质粒，其抗菌作用可能是灭活该耐药质粒或抑制了质粒介导的耐药性基因表达，这也说明这类中药的抗大肠埃希菌机制十分复杂。

克痢痧(由白芷、苍术、石菖蒲、细辛、荜茇、鹅不食草、猪牙皂、丁香、硝石、白矾、雄黄、冰片组成，浙江苏泊尔南洋药业有限公司)对大肠埃希菌有明显的抑菌作用，是治疗腹泻与细菌性痢疾的常用药物之一。李延鸿等[13]对耐庆大霉素、氨苄西林的致病性大肠埃希菌，加克痢痧培养24 h，用紫外透射仪检测凝胶分析系统摄像分析，显示质粒带消失，R质粒消除率为17.45%，与传统R质粒消除剂——十二烷基硫酸钠比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明克痢痧消除大肠埃希菌R质粒的作用是非常强大的。总体而言，中药消除质粒作用低于化学消质剂(如十二烷基硫酸钠)，而单味中药消除大肠埃希菌R 质粒的作用不及复方中药。

3 改变细菌外膜通透性

细菌外膜具有阻止抗生素等外来物质入侵的作用，使细菌自身得以生存和繁殖。大肠埃希菌外膜mar区基因突变导致F、C蛋白减少或缺失，使细菌细胞壁或外膜通透性改变而产生多重耐药性[14]。

千里光有清热解毒的功用，体外实验证明其能有效抑制大肠埃希菌。张文平等[15]用扫描电镜观察发现，经千里光处理的大肠埃希菌，菌体表面粗糙，部分菌体出现缢痕，并在缢痕处出现缢缩或断裂等变化；同位素前体参入试验发现大肠埃希菌DNA、RNA、蛋白质和肽聚糖合成也受到明显的抑制。这些作用可能与其有效成分黄酮类化合物有关。张金霞等[16]采用丙酮加热回流法对中药当归进行提取，其对大肠埃希菌的最低抑菌浓度为2 500 μg/ml。扫描电子显微镜发现测试菌变形，失去原有形态；大部分测试菌细胞壁和细胞膜破裂，内容物外溢。药物浓度越高，上述改变越明显。

黄衍强等[17]发现对氧氟沙星、环氧沙星和诺氟沙星等多重耐药性大肠埃希菌均出现解旋酶基因(gyrase subunit A，gyrA) 基因突变，主要是第83和87位点分别出现C-T和G-A的突变。在含黄连素、大黄素、苦参碱等提取物的胁迫环境下培养多重耐药性大肠杆菌30 d，传代15次，经PCR扩增gyrA基因，检测基因序列后未发现上述突变基因有回复迹象，认为黄连素、大黄素、苦参碱等对多重耐药大肠埃希菌的抑制作用，可能与生物膜被抑制或调控外排泵被黄连素、大黄素、苦参碱抑制有关，而与gyrA基因的突变回复无关。

罗芬芳[18]研究发现，黄藤素、没食子酸体外实验对产ESBLs的大肠埃希菌无抑制作用，但可提高β-内酰胺类抗生素的敏感性。单独的黄藤素或联合头孢噻肟与产ESBLs的大肠埃希菌增殖培养15代，采用实时荧光定量PCR检测产ESBLs的大肠埃希菌酶基因mRNA表达水平，发现ESBLs酶基因blaCTX-M-1G、blaCTX-M-9G的mRNA表达水平无明显改变，表明黄藤素的抗菌增敏感作用不是通过影响β-内酰胺酶mRNA表达水平实现的；单独的没食子酸或联合头孢噻肟与产ESBLs的大肠埃希菌增殖培养15代，对ESBLs酶基因blaCTx-M-1G mRNA表达水平无明显影响，但能降低ESBLs酶基因blaCTX-M-1G mRNA表达水平，没食子酸对头孢噻肟的增敏作用可能是通过这一机制实现的。

银花泌炎灵片(吉林华康药业股份有限公司)由车前子、桑寄生、金银花、半枝莲、灯芯草、半枝莲、萹蓄等清热利湿中药组成，治疗泌尿系感染、前列腺炎、慢性盆腔炎等疾病的总有效率达到90%。赛景影等[19]研究证明，银花泌炎灵片95%乙醇提取物对大肠埃希菌标准菌株ATCC2592和产ESBLs的大肠埃希菌有明显的抑制作用。扫描电子显微镜下观察，经银花泌炎灵片95%乙醇提取物作用后，超薄切片透射电子显微镜可见菌体固缩膨大，细胞壁模糊不清甚至缺失，细胞质固缩解体，形成小空泡；负染透射电子显微镜下可见菌体变形并出现褶皱，细胞壁出现凹陷。认为银花泌炎灵片的抑菌机制可能是药物干扰或破坏大肠埃希菌细胞壁合成或破坏菌体内大分子量蛋白，以致菌体超微结构出现改变。王槐栋等[20]在含左氧氟沙星的培养基中对大肠埃希菌ATCC25922连续传代，用DNA测序技术发现其编码parC基因第381位发生突变，A→T，其编码的赖氨酸(127)→天冬酰胺，并在第386位碱基插入T。而用银花泌炎灵片95%乙醇提取物则无此现象，说明在特定的环境压力下银花泌炎灵片不容易诱导大肠埃希菌发生耐药性，细菌外膜parC基因突变可能是细菌耐药性产生的原因之一。

4 干扰细菌的代谢

细菌可以通过改变自身的代谢途径以对抗抗菌药物而获得耐药性。细菌外膜存在一种能改变自身结构的膜蛋白，在细菌自身能量支持下将药物选择性或非选择性地排出细菌细胞外，如细菌外排泵，抗生素很容易诱导细菌外排泵的超表达，使细菌泵出更多的抗菌药物，从而使靶位的药物浓度明显降低以利于细菌生存，由此导致细菌耐药或多重耐药[21]。

尉景娟等[22]采用琼脂稀释法测定黄芩黄酮、大黄蒽醌、败酱草皂苷、白头翁皂苷、重楼皂苷A、大血藤鞣、丹参素及丹参酮ⅡA等8种中药单体的抑菌作用，发现其对产ESBLs的大肠埃希菌、不产ESBLs的大肠埃希菌均有抑菌作用，其体外最低抑菌浓度基本相同，说明这8种中药单体的抑菌作用不受ESBLs的影响，其机制可能与干扰细菌的代谢有关。桂勇等[23]报告乌梅、五倍子、黄连、黄芩对产ESBLs和非产ESBLs的大肠埃希菌株的体外抑菌活性，差异无统计学意义(P>0.05)。上述研究表明前述中药虽对ESBLs没有水解作用，而这些中药中含有的一些特殊成分如五倍子中的鞣酸、黄连中的小檗碱等却均能抑制和干扰细菌的代谢。

细菌外排泵抑制剂是提高抑菌敏感度的一条有效途径。张静等[24]用142种中药提取液对大肠埃希菌进行培养，发现其有明显的抑菌作用，用荧光定量PCR技术证实，这些中药是通过下调大肠埃希菌的外排泵acrA基因mRNA表达而实现的。进一步将142种中药提取液、乳酸环丙沙星加入大肠埃希菌培养基中发现，仅4种(2.8%)药液能促使菌体内药物外排量减少、储存量增加，从而提高药物的敏感性；124种(87.3%)中药提取物与乳酸环丙沙星(细菌外排抑制剂)联用表现为拮抗作用，说明大部分中药的抑菌作用不是通过细菌外排泵抑制机制实现的，而是存在其他作用机制。

5 提高机体免疫功能，消除炎症反应

提高机体免疫力、消除炎症反应是中药抗细菌耐药的机制之一。杨东等[25]用吸附树脂法、离子交换法和硅胶层析法，从白鲜皮水煎液中分离出生物碱类成分BXP-A。给小鼠注射抗内毒素/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)造成毒血症，然后给毒血症小鼠静脉注射BXP-A，发现BXP-A能较好地中和LPS的作用，抑制炎症细胞释放肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)和白细胞介素(interleukin，IL)-6，对热灭活的LPS 攻击所致脓毒症模型小鼠具有保护作用。

小檗碱是从黄连、黄柏等中药提取的生物碱，体外实验证明其具有抗细菌和病毒感染、抑制肿瘤转移、降血糖、改善心脑血管循环等功效。庄浩林等[26]报告其对产ESBLs的大肠埃希菌的最低抑菌浓度为62.5 g/L，并能降低血清TNF-α，IL-6含量，与抗生素联用则具有增敏作用。认为小檗碱保护大肠埃希菌所致的小鼠菌血症模型，是通过消除炎症反应、提高机体免疫功能实现的。

苗健等[27]对大肠埃希菌腹膜炎诱发的脓毒症大鼠模型，用复方清下汤(大黄、厚朴、 枳实、 芒硝、连翘、公英、 金银花、栀子、牡丹皮)灌胃，发现血清IL-1、IL-6水平明显降低(P<0.01)；组织病理显示肺湿/干比值明显降低(P<0.01)，镜下见肺毛细血管内皮细胞肿胀减轻，纤维素渗出减少，出血减轻，肺泡间隔变窄。认为复方清下汤对脓毒症大鼠的保护作用是通过消除炎症反应实现的。

顾向晨等[28]对大肠埃希菌感染的膀胱炎SD大鼠，灌注二丁二仙汤(地丁草、蒲公英、知母、黄柏、仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归)后膀胱刺激症状明显减轻，采用Western Blot法检测膀胱组织中的TNF-α、抑制性卡巴蛋白(inhibitor-kappaB α，IKBα)、磷酸化抑制性卡巴蛋白，发现其表达量明显下降，膀胱雌激素受体βmRNA明显上升(P<0.05)。认为二丁二仙汤预防泌尿道感染发生，其机制可能为上调血清雌激素，局部激活膀胱雌激素受体β，调节核转录因子kappa B通路，抑制IKBα磷酸化，下调TNF-α分泌。

6 问题与展望

大肠埃希菌耐药机制非常复杂，且变化迅速，是临床治疗中的一个棘手问题。近年的研究证明，清热解毒、燥湿泻火及活血化淤中药对大肠埃菌有较好的抑制作用，但研究多集中在体外抑制大肠埃希菌效果观察方面，对其有效成分、机理的研究不多。中药成分复杂，在人体内可能存在协同作用。从发现青蒿素并取得诺贝尔奖的启示中可见，构建新的方剂，纯化中草药的有效成分并弄清其分子结构，探讨其消除耐药的机理，是今后研究的方向。

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广西医药卫生科研课题(Z2010047)

刘坤友(1973～)，男，本科，副主任技师，研究方向：医学检验。

R 284

A

0253-4304(2016)06-0842-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.24

2018-01-18

2016-04-18)