外周血核因子κB及过氧化物酶Ⅲ在早期肝细胞癌患者中的表达水平及其应用价值▲

刘艳波 夏医君

(1 浙江大学医学院附属第四医院急诊医学科，义乌市 322000，E-mail：mazhongping_efy@163.com；2 内蒙古自治区人民医院肝胆胰脾外科，呼和浩特市 010017)

论著·临床研究

外周血核因子κB及过氧化物酶Ⅲ在早期肝细胞癌患者中的表达水平及其应用价值▲

刘艳波1夏医君2

(1 浙江大学医学院附属第四医院急诊医学科，义乌市 322000，E-mail：mazhongping_efy@163.com；2 内蒙古自治区人民医院肝胆胰脾外科，呼和浩特市 010017)

目的 探讨外周血核因子κB(NF-κB)及过氧化物酶Ⅲ(PrdxⅢ)在早期肝细胞癌(HCC)患者中的表达水平及其应用价值。方法 选择128例HCC患者(HCC组)、144例肝硬化患者(肝硬化组)以及100例健康人群(对照组)，测定各组血浆NF-κB、血清甲胎蛋白(AFP)、PrdxⅢ水平，采用受试者工作特征曲线对三者单独或联合诊断HCC的敏感度、特异度进行分析。结果 肝硬化组患者血浆NF-κB及血清PrdxⅢ水平均高于对照组(P<0.05)，HCC组血浆NF-κB及血清PrdxⅢ、AFP水平显著高于对照组、肝硬化组(P<0.05)，但肝硬化组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。NF-κB及PrdxⅢ联合诊断HCC的敏感度为89.41%，特异度为90.45%，而NF-κB、AFP及PrdxⅢ联合诊断HCC的敏感度为98.73%，特异度为91.16%，均高于单独诊断或其他两两联合诊断。结论 早期HCC患者外周血NF-κB及PrdxⅢ表达水平升高。NF-κB及PrdxⅢ联合检测或两者联合血清AFP检测均可提高HCC诊断的敏感度和特异度，对HCC的早期诊断具有十分重要的临床价值。

肝细胞癌；核因子κB；甲胎蛋白；过氧化物酶Ⅲ

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球患病率第5、致死率居于第3的恶性疾病[1-2]。流行病学资料表明，2011年我国肝癌新发病例约35.6万例，发病率为 26.39/10万，位居我国全部恶性肿瘤的第4位[3]。其具有发病迅速、恶性程度高、患者生活质量差等特点，为此早检测、早诊断、早治疗的“三早”原则对于干预肝癌疾病进程，提高患者生活质量具有重要意义。目前，血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)广泛应用于HCC的临床早期检测及筛查工作，但由于其诊断HCC的敏感度仅为40%～65%，特异度为76%～96%以及较高的假阴性和假阳性结果，因此，AFP作为HCC早期检测及筛查指标并不理想[4-6]。近年来，研究表明血浆核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活性变化与肝细胞受损再生、肝癌细胞周期紊乱、增殖密切相关，而过氧化物酶Ⅲ(peroxiredoxin Ⅲ，PrdxⅢ)的过度表达与HCC进程显著相关，且其在HCC早期诊断中有较高的灵敏性及特异性[7-8]。为此，本研究在健康及不同肝脏疾病人群中联合检测血浆NF-κB、血清AFP及PrdxⅢ水平，以探讨其联合检测在HCC早期诊断、筛查中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年11月至2015年10月浙江省杭州市余杭区中医院、浙江大学医学院附属第四医院普外科收治的128例HCC患者(HCC组)、144例肝硬化患者(肝硬化组)以及同期在体检中心进行健康体检的100例健康人群(对照组)为研究对象。其中，HCC的诊断参照《原发性肝细胞癌的临床诊断与分期标准》中的诊断标准[9]，并经手术或介入及病理证实；患者均采用TNM分期，均为0～Ⅰ期或Ⅱ期；肝硬化的诊断参照《病毒性肝炎防治方案》[10]中的诊断标准。HCC组患者的排除标准：(1)不符合肝细胞肝癌病理诊断标准；(2)接受术前及术后的经动脉化疗栓塞等辅助治疗；(3)发生远处转移，如术后的肝外转移术后；(4)术后生存期未超过1个月。肝硬化组患者的排除标准：(1)不符合肝硬化诊断标准；(2)肝外胆管梗阻者；(3)伴有病毒性肝炎甲、乙、丙、丁、戊型肝炎及酒精性肝病者；(4)自身免疫性肝炎或者合并其他免疫病如系统性红斑狼疮等。对照组均排除心、脑、肺、肝、肾、胰、脾等器官疾病及基础疾病者，且肝功能、肝炎标志物检查、腹部B超、查体等结果均提示正常。3组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 各组人群性别、年龄比较

1.2 血液标本的采集 采用两种不同的一次性真空采血管，清晨空腹抽取静脉血2份(每份3 ml)，其中一份用乙二胺四乙酸二钠盐抗凝剂处理，经离心(1 000 g/min，20 min)处理后，获得血浆并保存上清液于-20℃冰箱用于测定血浆NF-κB水平。另外一份不添加试剂的血样经离心(3 500 g/min，5 min)处理后，吸取上清，12 000 g/min离心10 min，弃去细胞碎片沉淀，吸取上清获得血清并保存于-20℃冰箱用于测定AFP及PrdxⅢ水平。HCC组及肝硬化组均于治疗前进行血清相关因子水平的检测。

1.3 细胞因子的测定 血浆NF-κB因子、血清PrdxⅢ的测定采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海美轩生物科技有限公司，生产批号MEXN-H0033-1412005、MEXN-H0267-1406012)进行测定。实验操作严格按照试剂盒说明说进行，主题步骤如下：依次将标本或标准品、生物素化的抗NF-κB或PrdxⅢ、HRP标记的亲和素加入往预先包被抗NF-κB或PrdxⅢ抗体的微孔中，经过经过温育并彻底洗涤。用底物显色，待测物质在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色；溶液显色的程度与待测物质中NF-κB或PrdxⅢ水平呈正相关。随即利用酶标仪(λ=450 nm)测定光密度(A值)，绘制标准曲线得出NF-κB或PrdxⅢ的浓度。血清AFP水平的测定采用电化学发光法，试剂、质控物及校准品均由罗氏公司提供(AFP试剂盒生产批号：152176；配套校准品生产批号：181650)，仪器为罗氏e601全自动电化学发光免疫分析仪。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料采用(x±s)表示，组间比较采用单因素ANOVA分析。AFP、NF-κB、PrdxⅢ因子诊断的准确性采用ROC曲线、ROC曲线下面积、95%CI进行评估。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组AFP、NF-κB、PrdxⅢ水平的比较 肝硬化组及HCC组患者血浆NF-κB及PrdxⅢ水平均高于对照组(P<0.05)；HCC组血浆NF-κB及PrdxⅢ水平均高于肝硬化组(P<0.05)。HCC组血清AFP水平显著高于对照组、肝硬化组(P<0.05)，但肝硬化组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组AFP、NF-κB、PrdxⅢ水平比较(x±s，ng/ml)

注：与对照组比较，aP<0.05；与肝硬化组比较，bP<0.05。

2.2 血浆NF-κB及血清AFP、PrdxⅢ单独或者联合检测HCC的ROC曲线分析 AFP+NF-κB+PrdxⅢ三者联合诊断的敏感度及特异度最高，其次为NF-κB+PrdxⅢ两者联合诊断，NF-κB单独诊断敏感度最低，AFP单独诊断特异度最低。见表3。

表3 血浆NF-κB及血清AFP、PrdxⅢ单独或者联合检测HCC的ROC曲线分析

3 讨 论

HCC是由慢性肝脏疾病，如慢性肝炎、肝硬化发展而来。HCC患者具有较低的生存率[11-12]，因此，对于HCC进行早期诊断及治疗非常重要。目前，大多数临床医师除了依据影像学技术诊断HCC外，还采用简便易行的检测血清AFP来评估HCC的严重程度。本研究结果显示，与肝硬化组及对照组比较，HCC组患者AFP水平显著升高(P<0.05)，这与Nagaoka等[13]的研究结果相似。但本研究HCC患者中有18例(28.1%)血清AFP水平低于400 ng/dl，且AFP特异性最低，灵敏度亦不高。而近年来也有研究显示，AFP由于较低的灵敏度及特异性并不能成为完全可靠的HCC早期诊断、预防及治疗的肿瘤标志物[14-15]。理想的肿瘤标志物应该具有较高的敏感性及特异性，且方便、易测量、微创、准确，能够被患者和医生普遍接受[16]。

近年研究发现，NF-κB是炎症的核心调节因子，肝硬化炎症反应过程及癌症进程所涉及的许多炎症因子都由NF-κB激活[17]。PrdxⅢ可防御活性氧自由基损害及保护细胞免受过氧化氢诱导的细胞凋亡[18]。本研究结果显示，与其他两组相比，HCC组患者血浆NF-κB及Prdx3水平显著升高(P<0.05)，这与Arsura等[19]的研究结果相似。Wu等[20]发现肝脏NF-κB在肝癌发生时异常增高。Yokoo等[21]报告与HCC癌旁组织相比，HCC癌组织中NF-κB持续激活。有学者提出NF-κB信号通路活化是人类肝癌进程中主要的分子事件之一[22]。故NF-κB在肝损伤、肝纤维化、肝癌进程中可能处于中心环节，有望成为肝癌预防及治疗的靶标[7]。PrdxⅢ在移除细胞活性氧时其表达增高，可抑制细胞凋亡，有益于肿瘤生长及侵袭[23-24]。Qiao等[25]对HCC组织及癌旁组织蛋白组学图谱进行比较后发现，与癌旁组织比较，94.9% HCC患者肿瘤组织的PrdxⅢ过表达，且PrdxⅢ的过表达与患者预后不良相关。这提示PrdxⅢ影响肝癌的进展，有望成为HCC潜在的治疗靶标。有研究报告血清PrdxⅢ诊断HCC的敏感性、特异性可分别达85.9%、75.3%[8]，与本研究结果相似。因此血清PrdxⅢ可作为诊断HCC及评估预后的非侵袭肿瘤标志物[8]。

此外，本研究结果显示，AFP、NF-κB和PrdxⅢ三项指标联合检测 HCC 的灵敏度、特异度均高于单项检测及两两联合检测，表明三项指标在诊断及鉴别诊断 HCC 方面具有优势。AFP、NF-κB和PrdxⅢ三项指标联合检测有望成为临床上早期诊断及鉴别诊断HCC的一个新思路，值得在临床上推广。

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Expression levels and application value of peripheral blood nuclear factor-kappa B and peroxiredoxin Ⅲ in patients with early-stage hepatocellular carcinoma

LIUYan-bo1,XIAYi-jun2

(1DepartmentofEmergency,theFourthAffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Yiwu322000,China; 2DepartmentofHepatobiliaryandPancreasSurgery,InnerMongoliaPeople′sHospital,Hohhot010017,China)

Objective To investigate the expression levels and application value of peripheral blood nuclear factor kappa B(NF-κB) and peroxiredoxin Ⅲ(PrdxⅢ) in patients with early-stage hepatocellular carcinoma(HCC).Methods A total of 128 patients with HCC(HCC group),144 patients with liver cirrhosis(liver cirrhosis group) and 100 healthy individuals(control group) were enrolled.The levels of plasma NF-κB,serum alpha-fetoprotein(AFP) and PrdxⅢ were measured in each group.The sensitivity and specificity of the three indices for the diagnosis of HCC alone or jointly were analyzed by receiver operating characteristic curve.Results The levels of plasma NF-κB and serum PrdxⅢ in the liver cirrhosis group were significantly higher than those in the control group(P<0.05),and the levels of plasma NF-κB,serum PrdxⅢ and AFP in the HCC group were higher than those in the control group or liver cirrhosis group(P<0.05).There was no significant difference between liver cirrhosis group and control group(P>0.05).The sensitivity and specificity of NF-κB combined with PrdxⅢ for diagnosing HCC were 89.41% and 90.45% respectively,and the sensitivity and specificity of NF-κB combined with AFP and PrdxⅢ for diagnosing HCC were 98.73% and 91.16% respectively,which were all higher than the sensitivity and specificity of each index alone or the other pairs.Conclusion The expression levels of peripheral blood NF-κB and PrdxⅢ increase in the patients with early-stage HCC.Either NF-κB combined with PrdxⅢ or the two indices combined with serum AFP can increase the sensitivity and specificity for diagnosing HCC,which has an important clinical value for the early diagnosis of HCC.

Hepatocellular carcinoma,Nuclear factor kappa B,Alpha-fetoprotein,Peroxiredoxin Ⅲ

内蒙古自然科学基金(2013MS11114)；内蒙古自治区人民医院院内基金项目(20110920)

刘艳波(1985～)，男，本科，主治医师，研究方向：急诊医学。

夏医君(1963～)，男，硕士，教授，研究方向：肝胆胰脾外科，E-mail：sunhaibin_bmyy@126.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)04-0467-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.06

2016-01-06

2016-03-17)