响应面法优化紫云英总黄酮提取工艺

钟少杰，何春梅，林 诚

(福建省农业科学院土壤肥料研究所 350013)

响应面法优化紫云英总黄酮提取工艺

钟少杰，何春梅，林 诚

(福建省农业科学院土壤肥料研究所 350013)

为确定紫云英总黄酮乙醇提取的最佳工艺条件，以总黄酮提取率为指标，采用响应面法对主要工艺参数进行优化，结果表明：提取紫云英总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度31%、液料比41、提取温度73℃、提取时间106 min，总黄酮提取率为3.698%，与预测值相对误差为0.4%。

紫云英；总黄酮；提取工艺

紫云英又名翘摇、红花草、草子，属豆科、黄芪属，作为绿肥近年在南方稻田恢复种植，以培肥地力、替代传统化肥。紫云英除肥田以外，可作饲草、可作蔬菜、可入药、可观赏，还是重要的蜜源植物，具有较强的富硒能力，对开发高附加值农产品意义重大。

黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、降血糖、降血脂、抗氧化等多种生理活性，广泛存在于植物体中[1-2]。目前对紫云英总黄酮提取工艺的研究较少，本研究采用紫外分光光度法测定紫云英总黄酮含量，应用浸提法对紫云英总黄酮提取进行研究，采用响应面法考察紫云英总黄酮的提取工艺中各因素对提取效果的影响，为紫云英的进一步开发利用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

搅拌机MJ-BL25C3(美的)，电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，数显恒温油浴锅(国华电器有限公司)，xMark酶标仪(BioRad公司)，芦丁(标准品 HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司)，无水乙醇(AR，西陇化工股份有限公司)，亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝均为分析纯。

供试紫云英品种为闽紫7号。

1.2 试验方法

1.2.1 比色法测定总黄酮含量 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[3]测定紫云英总黄酮含量，以芦丁为标准品，测定510 nm处的吸光度值，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制芦丁标准曲线，得到线性回归方程。

紫云英提取的待测液采用上述方法测定，测得的吸光度值代入线性回归方程，得到紫云英总黄酮质量浓度，通过公式(1)计算得总黄酮的提取率：

总黄酮提取率=(b×V)/(m×103)

(1)

式中，V：提取液体积(L)；m：紫云英的质量(g)；b：按照线性回归方程计算出的总黄酮质量浓度(mg/g)。

1.2.2 紫云英总黄酮提取工艺 紫云英用清水洗净，再用蒸馏水泡洗，50℃恒温烘干，粉碎，过60目筛，密封干燥保存，备用。准确称取一定量的紫云英粉末于烧瓶中，水浴恒温，根据设计的工艺条件，进行紫云英总黄酮提取，按1.2.1试验方法测定紫云英总黄酮提取质量，根据公式(1)计算总黄酮提取率。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验 对提取温度、液料比、乙醇浓度和提取时间4个主要因素进行优化，研究各因素对紫云英总黄酮提取率的影响。

1.3.2 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，运用Design Expert 8.05b软件，根据Box-Behnken试验设计原理，进一步优化提取工艺，以紫云英总黄酮提取率为响应值，考察提取温度(A)、液料比(B)、乙醇浓度(C)、提取时间(D)及各因素交互作用对响应值的影响，试验因素水平设计见表1。

表1 紫云英黄酮提取响应面分析因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素影响

2.1.1 提取温度 在液料比40、乙醇浓度30%和提取时间100 min的条件下，不同提取温度处理(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)对紫云英总黄酮提取率影响结果如图1A所示。在70℃时，总黄酮提取率最高；当温度高于70℃时，总黄酮提取率开始下降。究其原因可能是温度越高，分子热运动越激烈，乙醇分子与紫云英中的黄酮类物质碰撞次数越多，黄酮类物质溶出量越多，提取率就越高；当温度超过70℃时，紫云英总黄酮中的一些不稳定物质会被分解或氧化[4]，从而使黄酮的提取率下降。因此，提取紫云英总黄酮的最佳超声温度为70℃。

2.1.2 液料比 在乙醇浓度60%、提取温度70℃、提取时间120 min的条件下，不同液料比处理(10、20、30、40、50)对紫云英总黄酮提取率的影响如图1B所示。在40的液料比时，总黄酮提取率最高；当液料比大于40时，总黄酮提取率开始下降。究其原因可能是在液料比小于40时，紫云英与乙醇溶剂的接触不够充分，影响到黄酮类物质的溶出量。增大液料比可增大紫云英颗粒内外浓度差，减小黄酮从颗粒内部溶到乙醇溶剂中的阻力，提取率增大；但当液料比大于40时，过多的乙醇溶剂会增加浓缩带来的损耗，使得黄酮提取率下降。因此，综合考虑提取效率和减少溶剂用量，提取紫云英总黄酮的最佳液料比为40。

2.1.3 乙醇浓度 在液料比40、提取温度70℃、提取时间120 min的条件下，不同乙醇浓度处理(10%、20%、25%、30%、35%)对紫云英总黄酮提取率的影响如图1C所示。在乙醇浓度30%时，紫云英总黄酮的提取率最高；继续增加乙醇浓度，总黄酮提取率开始下降。究其原因可能是乙醇浓度小于30%，乙醇溶剂的极性随浓度的增大而减小，促进紫云英黄酮类物质溶解到乙醇溶剂中，总黄酮提取率增大；当乙醇浓度大于30%时，溶剂极性降低，黄酮溶出量减少，并且易造成亲酯性杂质(叶绿素等)溶出[5]，造成与黄酮类物质溶出竞争，使得提取率降低。因此，综合考虑提取率和成本，提取紫云英总黄酮的最佳乙醇浓度为30%。

2.1.4 提取时间 在液料比40、乙醇浓度30%、提取温度70℃的条件下，不同提取时间处理(60 min、80 min、100 min、120 min、140 min)对紫云英总黄酮提取率的影响如图1D所示。提取时间100 min，紫云英总黄酮的提取率最高；继续增加提取时间，总黄酮提取率开始下降。这与前人的研究结果类似，提取时间小于100 min，紫云英颗粒与乙醇溶剂接触时间较短，总黄酮溶出不完全，提取率降低；当提取时间大于100 min，热效应作用会破坏某些黄酮类物质，使得黄酮的提取率降低[6]。因此，综合考虑提取率和时间成本，最佳提取时间为100 min。

处理提取温度(℃)液料比乙醇浓度(%)提取时间(min)提取率(%)处理提取温度(℃)液料比乙醇浓度(%)提取时间(min)提取率(%)1-1-1002994160110357321-100329117-10-1031753-110031991810-10352341100338019-10103272500-1-1338120101033846001-13574210-10-13270700-11340822010-13311800113525230-10134919-100-13211240101342210100-13163250000361511-10013042260000371412100135542700003685130-1-10324228000036991401-1033392900003712150-1103297

2.2 紫云英总黄酮提取的响应面分析

2.2.1 模型的建立及显著性分析 综合单因素试验结果，利用Design Expert 8.05b软件，以紫云英总黄酮提取率为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，对提取温度(A)、液料比(B)、乙醇浓度(C)、提取时间(D)4个主要影响因素进行四因素三水平的响应面试验设计，结果见表2，方差分析见表3。

表3 紫云英总黄酮提取工艺回归方差分析

注：*表示P<0.05，显著；**表示P<0.01，极显著。

试验数据采用Design Expert 8.05b软件进行多元回归拟合，得到紫云英总黄酮提取率为目标函数的二次回归方程：Y=3.69+0.12A+0.044B+0.053C+0.046D+0.14AB-0.029AC-0.059AD-0.027BC-0.019BD+0.045CD-0.28A2-0.13B2-0.2C2-0.090D2

(2)

式中，Y：预测值、A：提取温度、B：液料比、C：乙醇浓度、D：提取时间。

方程中各项系数的绝对值的大小直接反映各因素对紫云英黄酮提取率的影响程度，系数的正负反映影响的方向[7]。由表3可知，该二次方程回归模型拟合极显著(P<0.0001)。回归方程一次项A和二次项A2、C2极显著(P<0.01)，一次项C、D和二次项B2、D2显著(P<0.05)，交互项AB显著(P<0.05)，其他交互项不显著(P>0.05)。说明紫云英总黄酮提取率与各试验因素之间不是简单的线性关系。回归方程的失拟检验不显著(F=4.26，P0.05)，说明未知的因素对该试验的干扰很小[8]。回归方程的相关系数R2=0.9296，表明该方程与实际情况拟合很好，所得的回归方程能较好预测紫云英总黄酮提取率随各影响因素变化的规律。4个影响因素的主效应顺序为提取温度>乙醇浓度> 提取时间>液料比。

2.2.2 紫云英总黄酮提取的响应面分析 紫云英总黄酮提取的响应面图如图2所示，各影响因素的相互作用及对总黄酮提取率的影响可以通过响应面坡度反映。图2 I的响应面坡度最为平缓，说明响应值随提取温度的变化大于液料比的变化，即对紫云英总黄酮提取率的影响提取温度大于液料比。图2 III的响应面的坡度平缓度次之，说明响应值随提取温度的变化大于提取时间的变化，即对紫云英总黄酮提取率的影响提取温度大于提取时间。其他各因素之间相似分析可得出其主效应顺序为提取温度>乙醇浓度>提取时间>液料比，与2.2.1中的分析结果一致。

2.2.3 最佳提取条件的确定和验证 在试验设定的各因素范围内，紫云英总黄酮最高提取率预测值为3.713%，最佳提取工艺条件：乙醇浓度30.86%、液料比41.15、提取温度72.55℃、提取时间105.54 min。校正工艺条件：乙醇浓度31%、液料比41、提取温度73℃、提取时间106 min。对优化试验结果验证，优化紫云英的黄酮提取率为3.698%，与预测值3.713%基本一致(n=3，相对误差为0.4%)。说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证该回归方程的正确性，表明响应面法适用于对紫云英总黄酮的乙醇提取工艺进行回归分析和参数优化。

3 结论

采用响应面法优化紫云英总黄酮提取工艺，建立的回归方程为Y=3.69+0.12A+0.044B+0.053C+0.046D+0.14AB-0.029AC-0.059AD-0.027BC-0.019BD+0.045CD-0.28A2-0.13B2-0.2C2-0.090D2。方差分析结果表明，拟合检验极显著，提取温度、乙醇浓度影响显著，该模型能较好地预测紫云英黄酮提取率随4个主要影响因素变化的规律。优化得到的提取紫云英总黄酮的最佳工艺条件：乙醇浓度31%、液料比41、提取温度73℃、提取时间106 min，此工艺条件下的紫云英黄酮提取率为3.698%，与理论预测值(3.713%)的相对误差为0.4%。说明该回归方程的拟合性很好。因此，响应面法优化紫云英总黄酮提取工艺条件是可行的，该研究为开发利用紫云英资源提供了基础理论与参考。

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(责任编辑：刘新永)

Optimization of extraction process of total flavonoids fromAstragalussinicusby response surface method

ZHONG Shao-jie, HE Chun-mei, LIN Cheng

(InstituteofSoilandFertilizerofFAAS,FujianProvince350013)

In order to determine the optimum process conditions of ethanol extraction of total flavonoids fromAstragalussinicus, the response surface method was adopted to optimize the main process parameters by using the extraction rate of total flavonoids as index. The results showed that the optimum condition of extracting total flavonoids fromAstragalussinicuswere 31% ethanol concentration, 41 solid-liquid ratio, 73℃ extraction temperature, 106 min extraction time, and the extraction rate of total flavonoids was 3.698% with 0.4% relative error to predicted value.

Astragalussinicus; total flavonoids; extraction process

2016-09-05

钟少杰，男，1985年生，研究实习员。

福建省公益类科研院所专项(2014R1022-9)；福建省种业项目(FJZ22Y-1530)；福建省科技计划项目(2015R1022-3)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.09.003