金樱子总黄酮的含量测定及酶提工艺优化

山光强，陈志刚，许广人，雷红宇，谭玉琴，苏建明

（湖南农业大学动物医学院，长沙410128）

金樱子总黄酮的含量测定及酶提工艺优化

山光强§，陈志刚§，许广人，雷红宇，谭玉琴，苏建明＊

（湖南农业大学动物医学院，长沙410128）

摘 要：为了测定金樱子中的总黄酮含量，并对其纤维素酶辅助提取工艺进行优化，本研究以芦丁为对照品，采用双波长分光光度法，确定测定波长500nm，参比波长580nm，对金樱子中的总黄酮含量进行测定；以总黄酮得率为评价指标，考察提取温度、乙醇浓度、纤维素酶用量、液料比等4个因素对总黄酮得率的影响，正交优化纤维素酶辅助提取金樱子总黄酮的工艺。结果表明，在19.90～398.00μg范围内，芦丁的质量与吸光度差值ΔA呈良好的线性关系（r＝0.9981），标准曲线方程为y＝0.0008x－0.0047，该方法下测得其得率为87.94mg／g，平均加样回收率98.23%，相对标准偏差为8.77%；正交试验优化的纤维素酶法辅助提取金樱子总黄酮的最佳工艺条件为：提取温度80℃、乙醇浓度40%、纤维素酶用量0.5%、液料比40∶1、提取时间90min、pH为6.0、提取次数2次，且各因素对金樱子总黄酮提取得率的影响顺序为：提取温度＞纤维素酶用量＞液料比＞乙醇浓度；在该提取条件下，金樱子总黄酮得率为（93.35±3.15）mg／g。因此，纤维素酶法辅助提取金樱子总黄酮可行，得率较高，条件温和。

关键词：金樱子；总黄酮；纤维素酶；正交试验；双波长分光光度法

金樱子（RosalaevigataMichx.）为蔷薇科蔷薇属植物，又名刺榆子、糖罐子、糖钵、金壶瓶，其果实味甜，是一种食药兼用的植物［1－2］。《本草纲目》记载金樱子“性酸、涩、平、无毒；主治脾泻下痢，止水便利，涩精气，久服令人耐寒轻身，补血益精，有奇效”［3］。目前的药理学研究发现，金樱子果实具有保肝护肾［4－6］、抗氧化［7］、清除自由基［8］及降糖降脂［9］等药理活性，且金樱子总黄酮（total flavonoids fromRosalaevigataMichx.，TFRx）对四氯化碳［10］、高脂食物［11］及对乙酰氨基酚［12］诱导的肝脏损伤有很好的保护作用，亚慢性毒性研究表明TFRx毒副作用小［13］。

目前，用于黄酮检测和定量分析的方法很多。其中，双波长分光光度法较HPLC法和荧光光度法等方法仪器易得，操作简便，价格低廉，而且该法能最大限度地克服底物中其他组分对黄酮波长测定的干扰，使得测定结果更为准确可靠，稳定性更佳［14－15］。正交试验设计是一种有效处理多因素优化问题的科学方法，能迅速有效地实现对部分因素的优化［16］。本研究在前期单因素试验［17］的基础上，采用乙醇－纤维素酶法辅助提取TFRx，以提取温度、乙醇浓度、纤维素酶用量、液料比等4个影响因素为主要考察指标设计正交试验，以期获得提取TFRx的最佳工艺，为金樱子的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1材料与试剂 金樱子购自湖南省长沙市楚济堂大药房；芦丁标准品、纤维素酶（≥1 800U／mg）均购自上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、盐酸、九水硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯；试验所用水为超纯水。

1.1.2仪器 FW177中草药粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司；UV－6100S紫外－可见分光光度计购自上海元析仪器有限公司；0.45μm有机针筒过滤器购自上海兴亚净化材料厂；GRX6干热消毒箱购自上海精宏实验设备有限公司；AY220电子分析天平（SHIMADZU）、40目标准检验筛均购自杭州萧山永发电器有限公司；DK－98－IIA电热恒温水浴锅购自天津市泰斯特仪器有限公司；CF16RXII冷冻高速离心机（Hitachi Koki）。

1.2试验方法

1.2.1TFRx含量测定

1.2.1.1芦丁标准品溶液的配制 精密称取19.9mg芦丁标准品，加入70%乙醇溶液，水浴溶解，定容至100mL容量瓶，得浓度为199.0μg／mL芦丁标准品溶液，4℃冰箱保存，备用。

1.2.1.2供试品溶液的配制 金樱子烘干，粉碎，过40目筛，得恒重金樱子粉末，室温封存，备用。准确称取1.0g粉末于50mL离心管，按照液料比40∶1，加入30%乙醇溶液和1.0%纤维素酶，调节pH至6.0，搅拌均匀，封口，在60℃恒温下水浴提取90min；提取完成，迅速将离心管放入90℃恒温水浴锅，灭活酶30s，离心，取出上清液；滤渣重复上述操作；合并2次提取液，定容至100mL。取溶液适量二次离心，上清液经过滤器过滤，得供试品溶液，4℃冰箱保存，备用。

1.2.1.3显色及测定方法 参照郭建红等［14］、郭亚健等［18］、李慕春等［19］方法，分别精密吸取一定量的芦丁标准品溶液或供试品溶液于10mL容量瓶，补加70%乙醇溶液至5mL，摇匀，然后加入0.3mL 5%亚硝酸钠，摇匀，静置5min，再加入0.3mL 10%硝酸铝，摇匀，静置6min后，加入4mL 4%氢氧化钠，补加0.4mL 70%乙醇溶液，摇匀静置15min，以试剂空白为参比溶液，分别在测定波长和参比波长下进行测定。

1.2.1.4测定波长和参比波长的选择 分别精密量取0.2mL供试品溶液与0.8mL芦丁标准品溶液，按1.2.1.3方法显色，以试剂空白为对照，在400～700nm范围内进行光谱扫描，扫描结果结合相关报道［12，14，19－20］，确定出该试验的测定波长和参比波长。

1.2.1.5标准曲线绘制 分别精密量取0、0.1、0.3、0.6、1.0、1.5、2.0mL芦丁标准品溶液，按1.2.1.3方法显色。以标准品质量为横坐标，吸光度差值ΔA＝A测－A参比为纵坐标，绘制标准曲线，拟合回归曲线方程。

1.2.1.6样品含量测定 精密量取一定体积的供试品溶液，按1.2.1.3方法项下操作，测定吸光度A测和A参比，并计算出其差值ΔA。将吸光度差值ΔA代入回归曲线方程，计算出吸取样品中TFRx含量m1，求TFRx得率。

1.2.2方法学考察

1.2.2.1精密度试验 精密量取一定量标准品溶液各5份，每份1mL，按1.2.1.3方法测定吸光度A测和A参比，并计算出其差值ΔA，ΔA平均值与RSD。

1.2.2.2加样回收率试验 取供试品溶液9份，每份0.2mL，分3组，各组分别加入0.2、0.5、0.8mL已知浓度的芦丁标准品溶液，混匀，按1.2.1.3方法测定吸光度A测和A参比，并计算出其差值ΔA、加样回收率、平均加样回收率与RSD。

1.2.3正交试验设计 根据前期试验结果，以提取温度（A）、乙醇浓度（B）、纤维素酶用量（C）和液料比（D）等4个因素为主要考察指标设计正交试验，采用L9（34）进行正交试验（表1）。按照1.2.1.3的方法，考察各因素各水平对TFRx得率的影响。

表1　正交试验因素与水平关系Table 1 Orthogonal test factors and levels relationship

2 结果与分析

2.1测定波长和参比波长的选择

测定波长和参比波长的选择见图1。由图1可知，供试品的最大吸收波长为496nm，标准品的最大吸收波长为510nm。因此，选取500nm为TFRx的测定波长，580nm为参比波长。

图1　测定波长和参比波长的选择Fig.1 Choosing of measuring wavelength and reference wavelength

2.2 标准曲线绘制

标准曲线见图2，方程为y＝0.0008x－0.0047，其中y代表吸光度差值，x代表样品质量。由图2可知，芦丁标准品的质量在19.90～398.00μg范围内线性关系良好（r＝0.9981）。

图2　标准曲线Fig.2 Standard curve

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验 精密度试验结果见表2。由表2可知，标准品溶液的RSD为1.24%，符合精密度试验要求，表明该方法具有良好的精密度，结果可靠。

表2　精密度试验结果Table 2 The results of precision experiments

2.3.2加样回收率试验 加样回收率试验结果见表3。由表3可知，平均加样回收率为98.23%，RSD为8.77%，符合加样回收率试验要求，表明该方法适合用于TFRx的含量测定，其结果的准确度较好。

表3　加样回收率试验结果Table 3 The results of recovery test

2.4正交试验

2.4.1正交试验结果 极差分析结果表明，影响TFRx提取得率的因素，按照由强到弱的顺序依次为A、C、D、B，即A＞C＞D＞B（表4）。因此，提取TFRx的最佳条件即为A3B2C1D3，即提取温度80℃、乙醇浓度40%、纤维素酶用量0.5%、液料比40∶1、提取时间90min、pH 6.0、提取次数2次。

表4　正交试验结果Table 4 The results of orthogonal test

2.4.2验证试验结果 在正交试验分析所得最佳提取条件下，按1.2.1.2的方法进行提取，考察TFRx提取得率。平行3次，结果见表5。结果表明，在最佳提取条件下提取TFRx得率较高，稳定性良好。

表5　最佳工艺条件验证试验结果Table 5 Test results of optimum process conditions

3 讨 论

目前，植物黄酮的提取方法有醇提法、热水提法、碱液提法、超声波助提法、酶浸渍法、超临界流体萃取法、微波法及超微粉碎提法［21］。本试验采用了醇提法与酶浸渍法相结合的方法提取TFRx，所用溶剂为乙醇，酶为纤维素酶。本研究结果与林宣贤［22］采用复合酶（纤维素酶＋果胶酶＋木瓜蛋白酶＋（葡聚糖酶＋半纤维素酶）处理金樱子干果所得得率2.56%相比具有较高的得率，推测其可能与所用酶、金樱子产地、采收期、提取方法、测定方法等不同有关。

此外，用于黄酮含量测定的方法包括了紫外分光光度法、液相色谱法、荧光光度法、薄层扫描色谱法及超临界流体色谱法等［21］。而多波长分光光度法就是紫外分光光度法中的一种，具有特定的抗吸收干扰、降低测定误差的效果，明显优于普通比色法，且该法操作简单。郭建红等［14］采用双波长分光光度法测定洋葱中黄酮含量，分别以510、580nm为测定波长和参比波长，得洋葱中黄酮含量为1.58mg／g；李慕春等［19］在相同测定波长和参比波长下测得奶花芸豆中总黄酮的含量为2.79mg／g。张兰杰等［20］分别以510、584nm为测定波长和参比波长，采用双波长分光光度法测得黑玉米花粉中总黄酮的平均含量为3.53%。可见，双波长分光光度法适用于黄酮含量的测定，且效率较高。因此，本试验采用NaNO2－Al（NO3）3－NaOH比色法进行显色，选取双波长分光光度法测定TFRx含量，分别以500、580nm为测定波长和参比波长，得总黄酮含量为87.94mg／g，平均加样回收率98.23%，RSD为8.77%。

单因素试验设计是一种经典的试验设计方法，但也存在着局限性，如不能反映因素与因素间的相互作用。现今，使用较多的工艺优化试验设计方法有正交试验设计和响应面设计，两者均可基于单因素试验的结果进行设计。其中响应面法能够拟合多因素与响应值间的函数关系，从而在一个区域内找出因素的最优组合和最佳响应值，但响应面法对试验点的选择要求很高，而正交试验设计也能够有效地筛选出优化后的因素水平组合，且正交试验设计具有方法简单、试验次数少的优点［23－24］。因此，本试验采用了4因素3水平的正交试验设计对TFRx的纤维素酶法辅助提取工艺进行了优化。

此外，徐鹏等［25］比较购于不同地区的金樱子后，发现地理环境因素和人为因素是引起不同产地TFRx含量差异的重要原因，且总黄酮含量范围为3.1%～5.3%；安冬琴等［26］分析采于不同时期的同一株金樱子中的总黄酮含量，发现总黄酮含量随着金樱子的成熟呈轻微下降趋势，并且得出金樱子中总黄酮的含量范围为3.02%～8.55%；吴家红等［27］考察了金樱子不同炮制品及生品中的总黄酮含量，发现TFRx的含量与炮制方法有关。本试验以总黄酮得率为评价指标，考察了提取温度、乙醇浓度、纤维素酶用量、液料比对TFRx得率的影响，确定了纤维素酶辅助提取TFRx的最佳工艺为提取温度80℃、乙醇浓度40%、纤维素酶用量0.5%、液料比40∶1、提取时间90min、pH为6.0、提取次数2次；以该工艺提取TFRx，可获得（93.35±3.15）mg／g的得率。该得率高于前期单因素试验中的得率（79.30±1.59）mg／g［17］，推测其可能与测定方法、金樱子产地、采收期、储存时间及粉碎处理等有关，而且本试验在单因素试验的基础上对部分条件进行了优选，如提取温度、液料比、提取时间、纤维素酶用量等。

4 结 论

本研究采用双波长分光光度法测定TFRx的含量，确定测定波长500nm，参比波长580nm，标准曲线方程为y＝0.0008x－0.0047，在19.90～398.00μg范围内有良好的线性关系。此外，各因素对纤维素酶法辅助提取TFRx的影响顺序为提取温度＞纤维素酶用量＞液料比＞乙醇浓度，正交试验优化的最佳工艺条件为：提取温度80℃、乙醇浓度40%、纤维素酶用量0.5%、液料比40∶1、提取时间90min、pH为6.0、提取次数2次，且在该提取条件下，TFRx得率较高。因此，本试验设计正交试验优化纤维素酶法辅助提取TFRx的方法可行，且得率较高，可为TFRx的深入研究开发提供参考。

参考文献：

［1］ 刘学贵，李佳骆，高品一，等.药食两用金樱子的研究进展［J］.食品科学，2013，34（11）：392－398.

［2］ 刘军海，黄宝旭，刘玉刚.金樱子总黄酮提取工艺的响应面法优化［J］.食品研究与开发，2010，31（11）：51－56.

［3］ 李时珍.本草纲目（下册）［M］.北京：人民卫生出版社，1978.

［4］ 许金华，秦振启，周钰娟，等.金樱子对糖尿病鼠肝氧化应激的影响［J］.中国实用医药，2010，5（21）：4－5.

［5］ 周钰娟，廖前进，张秋菊，等.金樱子对大鼠糖尿病肾脏的试验研究［J］.南华大学学报（医学版），2007，35（3）：332－335.

［6］ Li X，Cao W，Shen Y，et al.Antioxidant compounds fromRosaLaevigatefruits［J］.FoodChemistry，2012，130（3）：575－580.

［7］ 陈乃富，张 莉.金樱子黄酮类化合物的初步研究［J］.中国林副特产，2005，5：2－4.

［8］ 谢祥茂，丁小雯，陈俊琴.金樱子提取液对NO－2清除作用的体外试验研究［J］.食品科学，2001，22（1）：30－33.

［9］ 张秋菊，尹卫东，席守民，等.金樱子和鸡内金对饲高糖高脂兔血中糖、脂和胰岛素水平的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2003，11（3）：227－229.

［10］ Zhang S，Lu B N，Han X，et al.Protection of the flavonoid fraction fromRosalaevigataMichx fruit against carbon tetrachloride－induced acute liver injury in mice［J］.FoodandChemicalToxicology，2013，55（3）：60－69.

［11］ Zhang S，Zheng L L，Dong D S，et al.Effects of flavonoids fromRosalaevigataMichx fruit against highfat diet－induced non－alcoholic fatty liver disease in rats［J］.FoodChemistry，2013，141（3）：2108－2116.

［12］ Liu Y T，Lu B N，Peng J Y.Hepatoprotective activity of the total flavonoids fromRosalaevigataMichx fruit in mice treated by paracetamol［J］.FoodChemistry，2011，125（2）：719－725.

［13］ Zhang S，Zheng L L，Xu L N，et al.Subchronic toxicity study of the total flavonoids fromRosalaevigataMichx fruit in rats［J］.RegulatoryToxicologyand Pharmacology，2012，62（2）：221－230.

［14］ 郭建红，贾 楠，史 可，等.双波长分光光度法检测洋葱黄酮方法的建立［J］.食品工业，2015，36（7）：168－170.

［15］ 张学惠，巫巧鹤，李枝端.多波长系数法计算分光光度法与双波长法、三波长法等经典方法的异同［J］.海峡药学，2007，19（12）：116－117.

［16］ 刘瑞江，张业旺，闻崇炜，等.正交试验设计和分析方法研究［J］.试验技术与管理，2010，27（9）：52－55.

［17］ 陈志刚，山光强，雷红宇，等.纤维素酶辅助提取金樱子总黄酮单因素试验［J］.中兽医医药杂志，2016，35（1）：29－32.

［18］ 郭亚健，范 莉，王晓强，等.关于NaNO2－Al（NO3）3－NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨［J］.药物分析杂志，2010，22（2）：97－99.

［19］ 李慕春，王 飞.双波长分光光度法测定奶花芸豆总黄酮含量［J］.广东农业科学，2010，37（12）：110－111.

［20］ 张兰杰，辛 广，张维华.双波长分光光度法测定黑玉米花粉中总黄酮的含量［J］.食品科学，2006，27（2）：230－232.

［21］ 刘 璐，付明哲，王 侠，等.植物黄酮类化合物提取及测定方法研究进展［J］.动物医学进展，2011，32（6）：151－155.

［22］ 林宣贤.酶法提取金樱子总黄酮的研究［J］.中国食品添加剂，2009，4：117－121.

［23］ 陈 敬，温庆果，刘 韶，等.正交设计与响应面法优化壳聚糖对莲子心提取液除杂工艺对比研究［J］.中草药，2012，43（11）：2183－2188.

［24］ 林建原，季丽红.响应面优化银杏叶中黄酮的提取工艺［J］.中国食品学报，2013，13（2）：83－90.

［25］ 徐 鹏，胡素连，李云耀，等.不同产地金樱子中多糖和总黄酮的含量测定［J］.中国药师，2012，15（5）：648－650.

［26］ 安冬琴，宴建新，王晓丽.紫外测定不同产地不同采收期金樱子中总黄酮的含量测定［J］.安徽农业科学，2015，43（14）：79－80.

［27］ 吴家红，彭小冰，席希晔.金樱子不同炮制品中总黄酮含量的测定［J］.贵阳中医学院学报，2006，28（5）：60－62.

（责任编辑 秦 彤）

陈志刚（1992－），男，湖南攸县人，硕士生，研究方向：基础兽医学，E－mail：czgresearcher＠foxmail.com山光强和陈志刚对本文具有同等贡献，并列为第一作者

中图分类号：S859.3

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3156－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.011

收稿日期：2016－04－18

基金项目：地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目（12690）；湖南农业大学动物医学院大学生创新性实验计划项目（dycx1511）

作者简介：山光强（1994－），男，云南宜良人，学士，研究方向：动物药学，E－mail：sgqundergraduate＠163.com

通信作者：＊苏建明（1974－），男，湖南茶陵人，博士，副教授，研究方向：天然产物，E－mail：sjmauhn＠163.com

Content Determination of Total Flavonoids fromRosalaevigataMichx.Fruits and Optimization of Cellulase－assisted Extraction

SHAN Guang－qiang§，CHEN Zhi－gang§，XU Guang－ren，LEI Hong－yu，TAN Yu－qin，SU Jian－ming＊
（CollegeofVeterinaryMedicine，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China）

Abstract：To determine the content of total flavonoids fromRosalaevigataMichx.fruits，and optimize the process of cellulase－assisted extraction，the content of total flavonoids fromRosa laevigataMichx.fruits were determined with a double－wavelength spectrophotometry with detection wavelength were 500nm and 580nm as the reference，using rutin as a standard material，and the process of cellulase－assisted extraction designed by orthogonal test was optimized with the yield of flavonoids as the evaluation index，and the effects of extraction temperature，concentration of ethanol，cellulase dosage，ratio of liquid to material and other 4factors on the content of total flavonoids were investigated.It showed a good linearity（r＝0.9981）between absorbance difference（ΔA）and the rutin mass ranging of 19.90to 398.00μg，the standard curve equation was y＝0.0008x－0.0047，and the yield of total flavonoids was 87.94mg／g，the average recovery and RSD were 98.23%and 8.77%，respectively.And the optimumcellulase－assisted extraction conditions of total flavonoids fromRosalaevigataMichx.fruits by orthogonal array design were extraction temperature of 80℃，concentration of ethanol of 40%，cellulase dosage of 0.5%，ratio of liquid to material of 40∶1，extraction time of 90min，pH of 6.0，and extraction numbers of 2.Various factors affecting extracting yield were in a order of extraction temperature＞cellulasedosage＞ratio of liquid to material＞concentration of ethanol.In this condition of extraction，yield of total flavonoids fromRosalaevigataMichx.fruits was（93.35±3.15）mg／g.Therefore，it was suggested that extraction of total flavonoids fromRosalaevigataMichx.fruits by cellulase－assisted extraction was feasible，and the yield of total flavonoids was higher and its conditions was mild.

Key words：RosalaevigataMichx.fruits；total flavonoids；cellulase；orthogonal array design；doublewavelength spectrophotometry