大约克猪SLA－1原核表达载体的构建及表达

张秀娟，杨 杰，孙永强，高凤山

（大连大学生命科学与技术学院，大连116622）

大约克猪SLA－1原核表达载体的构建及表达

张秀娟，杨 杰，孙永强，高凤山＊

（大连大学生命科学与技术学院，大连116622）

摘 要：为构建大约克猪SLA－1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白，试验设计1对引物，经PCR扩增获得大约克猪SLA－1胞外区基因（命名为SLA－1－DYKe），将此片段克隆至pMD?19－T Simple Vector，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选阳性克隆菌并测序，将目的基因插入到原核表达载体pET－28a（＋）中，转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达，用SDS－PAGE检测目的蛋白的表达情况，大量诱导提取包涵体并检测。结果显示，PCR成功扩增SLA－1－DYKe的胞外区，得到大小为837bp的目的基因，目的基因成功克隆至pMD?19－T Simple Vector，并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA－1－DYKe／pET－28a（＋）表达载体，目的蛋白大小约为34ku。本研究成功构建了大约克猪SLA－1原核表达载体，获得了表达蛋白，为今后研究大约克猪SLA－1的空间结构和基因功能奠定了基础。

关键词：大约克猪；SLA－1基因；原核表达载体

大约克猪是中国引进的主要国外品系猪，其性能表现为增重快、饲料报酬高、瘦肉率高等，主要饲养在中国北方地区［1］。目前，国内已经对该品系猪进行了杂交等生产性能的研究［2－3］，然而，对于该品系猪基因资源方面的研究缺乏，尤其是涉及到与遗传相关的免疫应答基因。

主要组织相容复合体（major histocompatibility complex，MHC）是脊椎动物体内重要的免疫应答基因。按照功能和结构的不同分为3类，分别为：MHC－Ⅰ、MHC－Ⅱ、MHC－Ⅲ。其中，MHC－Ⅰ类分子是由重链（MHC－Ⅰ）和轻链（β2m）以非共价键结合的二聚糖蛋白。重链由一系列相互连锁的基因编码，具有高度的多态性。MHC－Ⅰ类分子分为3个区，包括细胞质区、穿膜区和胞外区。其中，胞外区包括α1、α2和α3亚区，每个亚区约含有90个氨基酸。α1和α2构成抗原多肽结合槽，结合8～10个氨基酸的多肽［4－7］。

猪MHC又称猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA），是一种膜外表达蛋白［8］，由Vaiman等［9］于1970年发现。SLA－Ⅰ类分子重链含有3个功能性基因，分别为：SLA－1、SLA－2和SLA－3。其中，SLA－2在信号肽的起始部位比SLA－1和SLA－3多3个氨基酸残基［10］。SLA－Ⅰ轻链分子只有一个等位基因β2m，二者非共价结合构成SLA－Ⅰ分子，在体内结合和递呈抗原表位［11－13］。在3个SLA－Ⅰ类分子功能基因中，SLA－1基因多态性最强。SLA－1基因在体外能够递呈抗原多肽，并引起细胞免疫应答，其相应的结构和功能研究正在展开。2012年，Ye等［14］报道了断奶后仔猪SLA－1及SLA－3在组织中的表达与大肠杆菌毒素基因F18的关系。Pedersen等［15］通过NetMHCpan软件预测口蹄疫病毒多肽，预测的多肽部分能够在体外与SLA－1＊0401结合，从而开始了SLA－1＊0401功能的研究。Cho等［16］建立了韩国本土猪SLA基因资源库，其中含有多个SLA－1等位基因；同时，还报道了国外引进托佩克猪SLA－1胞外区基因的克隆，以及国内部分地方饲养品系猪SLA－1基因的表达，但表达效果并不理想［17］。为进一步丰富猪SLA－1基因的结构和功能研究，本试验拟在前期研究的基础上，选取大约克猪SLA－1等位基因，构建其pET系列的原核表达载体，并获得高表达蛋白，为今后研究大约克猪SLA－1的空间结构及基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种及质粒 育肥期大约克猪SLA－1／pMD18－T质粒、表达载体pET－28a（＋）和大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21（DE3）菌株均由大连大学生命科学与技术学院基因和蛋白质工程实验室保存；pMD?19－T Simple Vector购自TaKaRa公司。

1.1.2主要试剂NdeⅠ、XhoⅠ、IPTG、DL2000DNA Marker、DNA Ligase、低分子质量蛋白质标准均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、氯化钠、TEMED、三羟甲基甲烷、过硫酸铵、丙烯酰胺、N’N’－二甲基甲叉双丙烯酰胺均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成 以大约克猪SLA－1为模板，设计扩增其胞外区的引物：pHBSLA－1－21FY（上游引物）：5′－GGGAATTCCATATGGGCCCGCATTCTCTGAGCTATTTC－3′；pHB21R－SLA－1－276（下游引物）：5′－AGTCTCGAGTTAAGGGTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTCC－3′。

1.2.2亚克隆SLA－1的胞外区 以SLA－1－DYK／pMD18－T为模板，以pHBSLA－1－21FY／pHB21R－SLA－1－276引物对扩增SLA－1胞外区（命名为SLA－1－DYKe）。PCR扩增体系50μL：质粒1μL，上、下游引物各1μL，10×ExTaqBuffer 5μL，dNTP（10mmo／L）1μL，ExTaq酶0.5μL，ddH2O补足体系。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性45s，66℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收目的基因，将目的基因与克隆载体pMD?19－T Simple Vector连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑取阳性克隆菌进行双酶切鉴定，鉴定正确后送生物公司测序。

1.2.3目的基因与表达载体pET－28a（＋）的连接与鉴定 从培养的TOP10菌液中提取质粒，进行双酶切，然后回收，得到SLA－1胞外区基因SLA－1－DYKe，同样将表达载体进行双酶切，回收，连接、转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布在含有Amp的培养基上，37℃过夜培养。然后挑取单菌落在含Amp的液体培养基过夜培养，提取质粒（质粒命名为pET－28a（＋）／SLA－1DYKe）。重组表达载体的构建见图1，NdeⅠ和XhoⅠ为限制性酶切位点；插入片段为SLA－1－DYKe，自带终止密码子TAA，插入片段长度为837bp，载体大小为5 369bp。

图1　大约克猪SLA－1原核表达载体构建Fig.1 Construction of SLA－1prokaryotic expressing vector in Yorkshire pig

1.2.4目的基因的诱导表达 取酶切鉴定连接成功的菌液100μL接种到5mL含Amp的LB培养基中，37℃、200r／min振荡培养使D600nm达到0.4～0.6。然后向培养液中加入5μL诱剂IPTG（1mol／L），培养5h后，取1mL培养液离心，收集菌体，菌体经2×SDS上样Buffer变性后，SDSPAGE检测目的蛋白是否表达。

1.2.5提取包涵体 取测序正确的菌液1mL接种到100mL含Amp的LB培养基中培养，使D600nm达到0.4～0.6，向培养液中加入100μL诱导剂IPTG（1mol／L），培养5h后，于4℃、4 000r／min离心10min，加入适量PBS，冰浴条件下超声波破碎菌体，离心后用Washing Buffer反复洗3次，包涵体用重悬Buffer悬起，6 000r／min离心15min，除细胞碎片、弃上清，称重。加入8mol／L尿素溶解包涵体，4℃过夜，SDS－PAGE检测。

2 结果与分析

2.1SLA－1胞外区基因的扩增

扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，得到约837bp的目的片段，与预期片段大小一致（图2）。

图2　SLA－1胞外区基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification ofSLA－1gene

2.2亚克隆酶切鉴定

用回收试剂盒将目的基因回收，然后与pMD?19－T Simple Vector连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶进行双酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在837bp处可见目的条带，与该片段理论值相符（图3）。

图3　重组质粒双酶切鉴定Fig.3 Identification of the recombinant vector cleaved usingNdeⅠandXhoⅠ

2.3构建及鉴定重组表达载体

将重组质粒SLA－1－DYKe／pMD19－T与pET－28a（＋）载体用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收、连接转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，NdeⅠ和XhoⅠ双酶切检测结果显示，插入片段约837bp，与理论值大小一致（图4）。

图4　重组表达质粒pET－28a／SLA－1－DYKe双酶切鉴定Fig.4 Identification of the recombinant plasmids pET－28a／SLA－1－DYKe cleaved usingNdeⅠandXhoⅠ

2.4重组基因的诱导表达

将筛选到的阳性重组菌经IPTG诱导，SDSPAGE检测结果发现有表达条带，大小约为34ku，与理论值相符（图5）。

2.5包涵体的提取

将鉴定为正确表达的重组菌大量诱导，提取包涵体，SDS－PAGE检测结果得到的SLA－1－DYKe包涵体蛋白条带大小约为34ku，与理论值相符（图6）。

图5　SDS－PAGE检测SLA－3－DYKe的表达Fig.5 The detection of expression of SLA－1－DYKe proteins by SDS－PAGE

图6　SDS－PAGE检测SLA－1－DYKe包涵体Fig.6 The detection of inclusion body of SLA－1－DYKe by SDS－PAGE

3 讨 论

大约克猪又称为大白猪、大约克夏猪，原产于英国。由于大白猪体型大，繁殖能力强，饲料转化率和屠宰率高及适应性强，养猪业发达的国家均有饲养，是世界上最著名、分布最广的主导瘦肉型猪种。

由于SLA在免疫调节及抗原递呈等方面起着重要的作用，近年来人们对于SLA的研究越来越多，陈茜茜等［18］构建了荷包猪SLA－2原核表达系并获得了SLA－2的目的蛋白；姜巍等［19］报道了烟台黑猪SLA－2原核表达载体的构建并获得表达蛋白；苟东洲等［20］构建中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA－3原核表达载体并获得了目的蛋白。

SLA－1和SLA－2、SLA－3基因作为SLA－Ⅰ类分子的功能基因座，在体外能够递呈抗原多肽，并引起细胞免疫应答，对于系统地研究SLA具有重要的作用。目前，国内外对猪SLA－1的表达研究报道不多，对其相应的结构和功能研究未系统地展开。课题组曾经报道了国外引进托佩克猪及国内部分地方品系猪SLA－1基因在pET－21a（＋）载体中的表达［16－17］，但到目前为止，大约克猪SLA－1基因的表达研究鲜有报道。本研究在前期研究的基础上，利用pET－28a（＋）载体成功表达了大约克猪SLA－1胞外区基因，且蛋白表达含量在整个菌体蛋白中呈优势表达，并获得了其包涵体蛋白。相较于前人报道pET－21a（＋）载体所表达的蛋白，本研究利用pET－28a（＋）载体所表达的蛋白质带有His标签，便于今后进行蛋白质的亲和纯化；然而不利之处为pET－28a（＋）表达蛋白所携带的His标签蛋白可能会对蛋白的折叠产生轻微的影响，如果做精细的结构研究，需要将His标签通过蛋白酶酶切掉，这为后续试验带来了一些额外的工作量。

4 结 论

本试验成功构建了大约克猪SLA－1原核表达体系，成功表达了SLA－1基因，获得了包涵体蛋白，为今后进一步研究大约克猪SLA－1的结构及功能奠定了基础。

参考文献：

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（责任编辑 晋大鹏）

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3121－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.006

收稿日期：2016－06－16

基金项目：国家自然科学基金项目：猪源病毒CTL多肽表位与SLA－Ⅰ结晶研究（31172304）；2015年辽宁省大学生创新创业训练计划项目：育－大约克猪SLA－1原核表达载体的构建及表达研究（20150086）；2014年大连大学大学生创新创业训练计划项目重点项目：育－大约克猪SLA－1原核表达载体的构建及表达研究（2014066）

作者简介：张秀娟（1993－），女，甘肃平凉人，学士，研究方向：生物工程，E－mail：1270853789＠qq.com

通信作者：＊高凤山（1971－），男，河北怀安人，博士，教授，研究方向：分子免疫学和分子生物学，E－mail：gfsh0626＠126.com

Construction and Expression of SLA－1Prokaryotic Expressing Vector in Yorkshire Pig

ZHANG Xiu－juan，YANG Jie，SUN Yong－qiang，GAO Feng－shan＊
（CollegeofLifeScienceandTechnology，DalianUniversity，Dalian116622，China）

Abstract：In order to construct the prokaryotic expressing vector of SLA－1derived form Yorkshire pig and express the interest of protein，apair of primers was designed to amplify the extracellular domain ofSLA－1gene from Yorkshire pig（named SLA－1－DYKe）by PCR.Then the PCR product was cloned into pMD?19－T Simple Vector and transformed intoEscherichiacoliTOP10.After cleaved byNdeⅠandXhoⅠ，the positive clones were selected to be sequenced.Analyzing by biological soft，the fragment from positive clone with correct sequence was inserted into pET－28a（＋）and transformed intoE.coliBL21（DE3）.After induction and expression，the interest of protein was detected by SDS－PAGE.The results showed that the extracellular domain of SLA－1－DYKe was successfully amplified with the fragment length of 837bp.The interest ofSLA－1gene was successfully cloned into pMD?19－T Simple Vector and the positive recombinant plasmids with correct sequences were obtained.The SLA－1－DYKe from positive recombinant plasmids was further inserted into pET－28a（＋）.After transformed intoE.coliBL21（DE3）and induction，the SLA－1－DYKe was successfully expressed.The molecular weight of the protein was about 34ku.It was concluded that the prokaryotic expressing vector of SLA－1was constructed successfully from Yorkshire pigs and then the expressed protein was obtained，which would lay a base for studying on the structure and function of SLA－1from Yorkshire pig in the future.

Key words：Yorkshire pig；SLA－1gene；prokaryotic expressing vector