白藜芦醇阻断转化生长因子-/Smad通路抑制人结肠癌细胞系SW480侵袭转移实验研究

宋康杰

白藜芦醇阻断转化生长因子-/Smad通路抑制人结肠癌细胞系SW480侵袭转移实验研究

宋康杰

目的探讨中药白藜芦醇对SW480细胞活力及侵袭转移力的影响。方法将人结肠癌细胞系SW480用白藜芦醇处理48h，MTT法检测白藜芦醇对SW480细胞活力的影响；流式细胞术检测白藜芦醇对SW480细胞周期的影响；Transwell穿膜试验检测白藜芦醇对SW480细胞侵袭转移能力的影响；western blot实验检测肿瘤细胞转移相关蛋白E-上皮型细胞钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达水平；Western blot实验检测上游磷酸化Smad蛋白（p-Smad）的表达水平。结果对照组及5、10、15、20、40μmol/L白藜芦醇组对SW480细胞活力的抑制率分别为0、（5.4±1.0）%、（22.5±3.3）%、（36.4±4.4）%、（62.2±6.1）%、（85.1±7.5）%，各组间细胞活力抑制率差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组及5、10、15、20、40μmol/L白藜芦醇组对SW480细胞周期G2/M阻滞率分别为（2.3±0.3）%、（4.3±0.5）%、（8.9±1.2）%、（15.6±2.3）%、（22.7± 2.7）%、（30.4±2.9）%，各组间G2/M阻滞率差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组及转化生长因子-β （TGF-β）组、TGF-β+5μmol/L白藜芦醇组、TGF-β+10μmol/L白藜芦醇组、TGF-β+15μmol/L白藜芦醇组、TGF-β+20μmol/L白藜芦醇组、TGF-β+40μmol/L白藜芦醇组穿过Transwell膜的SW480细胞数分别为（204.2±19.4）个、（453.5±41.6）个、（411.2±45.2）个、（315.7±32.7）个、（246.3±27.2）个、（197.8±23.5）个、（97.4±11.2）个，各组间细胞数差异有统计学意义（P＜0.05）。白藜芦醇体外处理置于TGF-β培养体系中的SW480细胞后，E-cadherin表达水平显著上升，Vimentin及MMP-9表达水平显著下降（P＜0.05）。白藜芦醇显著降低TGF-β诱导的SW480细胞Smad蛋白磷酸化水平。结论白藜芦醇有良好的体外抗结肠癌的生物活性，更重要的是它能通过阻断TGF-β/Smad通路抑制结肠癌细胞的侵袭转移。

结肠癌细胞；SW480；白藜芦醇；转移；TGF-β；Smad

目前认为[1-2]，肿瘤微环境中的很多细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、肝生长因子（HGF）和表皮生长因子（EGF）等能诱导肿瘤细胞发生侵袭转移。其中，TGF-β与肿瘤的转移关系尤为密切。本研究探讨中药白藜芦醇是否对结肠癌的生长和转移有抑制作用，同时研究其具体机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及培养 人结肠癌细胞系SW480来源于美国模式菌种收集中心（ATCC），细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。

1.2 实验试剂 DMEM培养基及胎牛血清购于美国Gibco公司。白藜芦醇、噻唑蓝（MTT）、TGF-β、碘化丙啶（PI）购于美国Sigma公司。LY2109761购于美国AdooQ公司。E-上皮型细胞钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、磷酸化Smad蛋白（p-Smad）及β-肌动蛋白（βactin）抗体购于美国cell signaling公司。Transwell小室购于美国康宁公司。ECL试剂盒购于美国Pierce公司。

1.3 MTT试验 将SW480细胞按5×103个/孔接种于96孔板，加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培养，设置3个复孔。在培养体系中分别加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜芦醇培养48h，对照组为不加白藜芦醇同样条件培养48h。加入20μL 5mg/mL MTT继续培养4h。弃上清，往孔中加入150μL二甲亚砜，充分震荡后在570nm波长下用酶标仪检测OD值。按以下公式计算SW480的细胞活力抑制率：抑制率=（对照组OD值-白藜芦醇组OD值）/对照组OD值×100%。

1.4 细胞周期检测 将SW480细胞按5×105个/孔接种于6孔板，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培养。在培养体系中分别加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜芦醇培养48h，对照组为不加白藜芦醇同样条件培养48h。收集细胞用生理盐水洗2次，用70%乙醇在4℃固定过夜后用生理盐水清洗，加入（50μg/mL）RNA酶，100μg/mL PI在暗处染色30min后用流式细胞仪检测细胞周期，G2期细胞所占比率可表示为肿瘤细胞进入G2/M阻滞[3]。

1.5 Transwell穿膜实验检测SW480细胞转移能力

在Transwell小室中接种1×104个SW480细胞置于24孔板中，上室培养基为无血清DMEM培养基并加入5ng/mL TGF-β模拟肿瘤微环境。在上室中分别加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜芦醇。下室培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基。48h后取出Transwell小室，用生理盐水洗去小室内未附着于Transwell膜的细胞，将Transwell膜用3%多聚甲醛固定20min后用0.1%结晶紫染色20min，低倍镜（100×）观察4个随机选择的区域，计算细胞总数。膜上细胞数目越多，说明SW480细胞的转移能力越强。

1.6 Western blot试验 将SW480细胞按5×105个/孔接种于6孔板，加入2mL含10%胎牛血清及5ng/mL 的DMEM培养。在培养体系中分别加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜芦醇培养48h，对照组为不加白藜芦醇同样条件培养48h。培养完成后将细胞裂解，取等量蛋白提取液在12.5%的丙烯酰胺中进行SDSPAGE，之后将凝胶取下将蛋白转膜到PVDF膜上。将膜分别在E-cadherin、Vimentin、MMP-9、p-Smad 及β-actin抗体中孵育过夜，之后在带辣根过氧化物酶活性的二抗稀释液中孵育2h，ECL试剂显色曝光，于暗室中曝光X胶片，以目的蛋白与β-actin蛋白显色后的灰度比值表示目的蛋白的相对表达水平。

2结果

2.1 白藜芦醇对结肠癌细胞系SW480细胞活力和细胞周期的影响 MTT结果和细胞周期检测结果表明白藜芦醇在体外能显著抑制SW480的细胞活力，同时，使SW480细胞进入G2/M阻滞，阻断肿瘤细胞的细胞周期，见表1。

表1 白藜芦醇对SW480细胞活力和细胞周期的影响（±s）

表1 白藜芦醇对SW480细胞活力和细胞周期的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与5μmol/L白藜芦醇组比较，＃P＜0.05；与10μmol/L白藜芦醇组比较，□P＜0.05；与15μmol/L白藜芦醇组比较，△P＜0.05；与20μmol/L白藜芦醇组比较，&P＜0.05.

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2.2 白藜芦醇对结肠癌细胞系SW480侵袭转移能力的影响 Transwell穿膜实验结果表明白藜芦醇能显著降低TGF-β诱导的SW480细胞转移能力，并使肿瘤细胞多种转移相关基因表达谱发生改变，见表2。

2.3 白藜芦醇通过阻断 TGF-β/Smad通路抑制SW480细胞的转移 Western blot结果表明白藜芦醇（20μmol/L）可显著抑制TGF-β诱导的Smad蛋白的磷酸化，进而抑制SW480细胞的转移并改变转移相关蛋白谱的表达水平，TGF-β/Smad通路特异性抑制剂LY2109761[4]（5μmol/L）对SW480细胞的生物效应与白藜芦醇（20μmol/L）相似，证明了TGF-β/Smad通路是白藜芦醇的靶位点，见表3。

表2 白藜芦醇对TGF-β诱导的SW480细胞转移能力的影响（±s）

表2 白藜芦醇对TGF-β诱导的SW480细胞转移能力的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与TGF-β组比较，§P＜0.05；与TGF-β+5μmol/L白藜芦醇组比较，＃P＜0.05；与TGF-β+10μmol/L白藜芦醇组比较，△P＜0.05；与TGF-β+15μmol/L白藜芦醇组比较，□P＜0.05；与TGF-β+20μmol/L白藜芦醇组比较，○P＜0.05；TGF-β：转化生长因子-β；E-cadherin：E-上皮型细胞钙黏蛋白；β-actin：β-肌动蛋白；Vimentin：波形蛋白；MMP-9：基质金属蛋白酶-9

表3 白藜芦醇对SW480细胞TGF-β/Smad通路的影响（±s）

表3 白藜芦醇对SW480细胞TGF-β/Smad通路的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与5ng/mL TGF-β组比较，▲P＜0.05；p-Smad：磷酸化Smad蛋白；TGF-β：转化生长因子-β；E-cadherin：E-上皮型细胞钙黏蛋白；β-actin：β-肌动蛋白；Vimentin：波形蛋白；MMP-9：基质金属蛋白酶-9

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3 讨论

研究[5-7]表明白藜芦醇有十分良好的抗肿瘤效应，如白藜芦醇可上调促凋亡蛋白的表达诱导纤维肉瘤细胞发生凋亡；白藜芦醇通过激活P38和JNK介导的H2AX磷酸化诱导白血病细胞发生凋亡；白藜芦醇还可通过ROS途径诱导卵巢癌细胞的死亡等。本研究发现白藜芦醇具有显著的体外抗结肠癌作用，能显著抑制结肠癌细胞的细胞活力，并将结肠癌细胞的细胞周期阻滞在G2/M期，抑制肿瘤细胞的增殖。

研究显示，通过Transwell穿膜实验证明白藜芦醇可有效抑制TGF-β介导的结肠癌细胞的转移，改变结肠癌细胞的肿瘤转移相关蛋白表达谱。E-cadherin作为一种钙依赖性地跨膜糖蛋白，是调节细胞与细胞之间黏附反应的重要媒介，是维护上皮细胞形态和结构完成的重要分子。研究[8]表明，E-cadherin表达的缺失可促使肿瘤细胞之间黏附力下降，进而使肿瘤细胞变地松散并倾向于向周围组织浸润，增加肿瘤的恶性程度。Vimentin和MMP-9是肿瘤细胞向周围基质细胞侵袭扩散的必须蛋白，研究[9-10]表明，Vimentin和MMP-9基因的表达水平越高，肿瘤的恶性程度越高。本研究发现白藜芦醇可显著上调结肠癌细胞E-cadherin的表达，下调Vimentin和MMP-9的表达，进而抑制结肠癌的侵袭转移。

TGF-β/Smad信号通路与肿瘤细胞的增殖、分化和转移密切相关。在这一系统中，TGF-β通过与TGF-βRI受体结合激活下游分子Smad发生磷酸化，激活Smad复合物。该复合物能进入细胞核调节多种基因的转录，如下调E-cadherin的表达水平，上调Vimentin和MMP-9的表达水平，从而促进肿瘤组织的上皮细胞间质转型（EMT），使肿瘤细胞发生转移[11-12]。本研究结果证明，白藜芦醇可显著抑制TGF-β介导Smad磷酸化，这可能是白藜芦醇抑制结肠癌细胞转移的重要机制。

综上所述，本研究提示白藜芦醇有潜在的抗结肠癌的生物效应，可显著降低结肠癌的转移倾向，其机制可能为白藜芦醇可显著抑制TGF-β介导Smad磷酸化，为结肠癌的药物治疗提供了新的途径和理论依据。

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（收稿：2015-05-06 修回：2015-08-07）

Resveratrol Inhibited the Metastasis of Colon Cancer SW480 Cells Via Suppressing the TGF-/Smad Path－way

SONG Kangjie. Department of Pharmacy,Ningbo Beilun Maternal＆Child Care Hospital,Ningbo(315800),China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on the cell viability and metastasis in SW480 cells in vitro.MethodsSW480 cells were treated with resveratrol for 48h:the cell viability was measured by MTT assay,the cell cycle was evaluated by flow cytometry analysis,and the metastasis was evaluated by Transwell assay. Metastasis associated proteinsE-cadherin,vimentin and MMP-9 in SW480 cells treated with resveratrol were detected by using Western Blot analysis.The upstream pathway proteinphosphorylated Smad（p-Smad）was detected in SW480 cells treated with resveratrol by Western Blot analysis.Results Cell viability inhibitory rate of SW480 cells in control group,5μmol/L resveratrol group,10μmol/L resveratrol group,15μmol/L resveratrol group,20μmol/L resveratrol group,and 40μmol/L resveratrol group were 0,（5.4±1.0）%,（22.5±3.3）%,（36.4±4.4）%,（62.2±6.1）%, and（85.1±7.5）%,respectively,with a significant difference among them（P＜0.05）.The cell cycle G2/M inhibitory rate of SW480 cells in above groups were as follows:（2.3±0.3）%，（4.3±0.5）%，（8.9±1.2）%，（15.6±2.3）%，（22.7± 2.7）%，and（30.4±2.9）%,with a significant differenceamong groups（P＜0.05）.The number of cells thatpenetrated the Transwell membrane in control group,TGF-β group,TGF-β+5μmol/L resveratrol group,TGF-β+10μmol/L resvera－trol group,TGF-β+15μmol/L resveratrol group,TGF-β+20μmol/L resveratrol group,and TGF-β+40μmol/L resveratrol group were as follows:204.2±19.4,453.5±41.6,411.2±45.2,315.7±32.7,246.3±27.2,197.8±23.5,97.4±11.2, with a significant differenceamong groups（P＜0.05）.Western blot analysis showed the expression of E-cadherin was significantly up-regulated,while the Vimentin and MMP-9 were down-regulated by resveratrol treatment in SW480 cells（all P＜0.05）.The expression ofp-Smad was significantly down-regulated when SW480 cells were treated with resveratrol.ConclusionResveratrol showed a significant anti-tumor effect in human colon cancerin vitro.More importantly,resveratrol could inhibit the metastasis of SW480 cells via suppressing the TGF-/Smad pathway.

colon cancer cells;SW480;resveratrol;metastasis;TGF-β;Smad

浙江省宁波市北仑区妇幼保健院药剂科（宁波 315800）