正交设计法优化赤灵芝中碱溶性纯化多糖的提取工艺

王 景，蔡雪峰

（华中科技大学同济医学院附属协和医院西院，湖北 武汉 430056）

正交设计法优化赤灵芝中碱溶性纯化多糖的提取工艺

王 景，蔡雪峰*

（华中科技大学同济医学院附属协和医院西院，湖北 武汉 430056）

以赤灵芝为原料提取碱溶性多糖，考察了提取时间、提取温度、液料比、NaOH浓度及提取次数对碱溶性多糖提取率的影响，并采用正交设计试验，确定了赤灵芝中碱溶性多糖最佳提取工艺参数，即提取时间2 h，提取温度60 ℃，液料比15 mL/g，NaOH质量浓度5%以及提取次数3次。验证性试验中实际测得碱溶性多糖平均提取率为10.98%，证明该优化工艺稳定可靠，切实可行。

赤灵芝；正交设计试验；碱溶性纯化多糖；提取工艺

赤灵芝(Ganoderma lucidum)属担子菌纲(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)灵芝科(Ganodermatcet)灵芝属(Ganoderma)，是一种珍贵的药、食两用高等真菌[1]，具有扶正固本、抗肿瘤、免疫活性、滋补强壮、抗放射之功效[2]。研究表明[3]，赤灵芝含有多糖、蛋白质、氨基酸、多肽、萜类、甾类、生物碱、有机酸挥发油、多种酶、链烷烃以及和油脂等。其中灵芝多糖是灵芝中主要有效成分之一，药理研究表明[4-5]，碱溶性多糖具有良好的体外抑制肿瘤细胞生长作用，为了提高赤灵芝碱溶性多糖的提取率，本文采用正交设计试验，对其提取工艺进行优化研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤灵芝购自山东泰安；NaOH、无水乙醇、苯酚、浓H2SO4均为分析纯。Seven Compact S220多参数测定仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Inifnite M200 Pro酶标仪，Tecan Austria Gmbh；DHG-9246A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；TD5A-WS台式低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；BZFS-02型万能高速粉碎机，西安宝正实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 碱溶性多糖的提取

先将赤灵芝子实体置于50℃烘箱中烘干，粉碎过2号筛，95%乙醇超声脱脂3次，弃去滤液，残渣置于50℃烘箱中烘干，超微粉碎，过200目筛，得赤灵芝子实体粉。称取5 g，按一定条件（提取时间、提取温度、液料比、碱浓度和提取次数）进行提取，离心，滤液4℃冰箱保存备用。

1.2.2 碱溶性多糖的纯化

采用Sevage法脱蛋白[6]，脱蛋白多糖溶液加入适量无水乙醇，使乙醇终浓度为30%，置4℃冰箱中沉淀过夜，5000 r/min离心15 min，弃去沉淀，上清液再加入无水乙醇使乙醇终浓度为70%，置4℃冰箱中沉淀过夜，5000 r/min离心15 min，弃去上清液，所得沉淀经真空干燥既得赤灵芝碱溶性纯化多糖。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖100 mg，置于250 mL容量瓶中， 加蒸馏水使溶解并定容至刻度，摇匀即得浓度为0.40 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。分别精密量取标准溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL置于具塞试管中，分别加蒸馏水至2.0mL，另取蒸馏水2.0mL作为空白对照，各加5%苯酚（重蒸）溶液1.0mL，摇匀，再各加浓硫酸5.0 mL，迅速摇匀，于室温下放置30 min，于波长490 nm下测定吸光度。以吸光度（A）对葡萄糖溶液浓度（C）作回归处理，得回归方程：A=9.527C+0.0065，R2=0.9993，具有良好的线性相关。

1.2.4 碱溶性多糖提取率（%）的测定

称取20 mg干燥的赤灵芝纯化多糖样品， 溶于适量热蒸馏水中，冷至室温后定容至250 mL，用硫酸-苯酚法[7]测定多糖含量。多糖提取率计算公式为（%）=所测多糖含量（g）×100%/供试赤灵芝子实体粉重量（g）。

1.2.5 单因素试验

在固定其他条件不变的基础上，分别考察提取时间(X1)、提取温度(X2)、液料比(X3)、碱浓度(X4)和提取次数(X5)对赤灵芝碱溶性多糖提取率的影响，每组试验重复3 次。

1.2.6 正交设计试验

以提取时间、提取温度、液料比、碱浓度和提取次数为试验因素，根据单因素试验结果设计一个5因素4水平试验16次的正交设计试验，即L16(45)设计表，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对碱溶性多糖提取率的影响

在试验条件为提取温度60℃、液料比20 mL/g、NaOH浓度5%、提取次数1次的条件下，提取时间分别选择为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h进行试验，结果表明，先是随着提取时间的增加，碱溶性多糖的提取率不断提高，但2 h之后，随着时间增加反而呈现下降趋势，因此确定提取时间为2 h。

2.1.2 提取温度对碱溶性多糖提取率的影响

在试验条件为提取时间2 h、液料比20 mL/g、NaOH浓度5%、提取次数1次的条件下，提取温度分别选择为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃进行试验，结果表明，一开始随着提取温度的升高多糖提取率显著增加，当温度超过60℃时，由于高温条件下会导致部分多糖水解，从而导致多糖提取率明显降低，因此确定提取温度为60℃。

2.1.3 液料比对碱溶性多糖提取率的影响

在试验条件为提取温度60℃、提取时间2 h、NaOH浓度5%、提取次数1次的条件下，液料比分别选择为10 mL/g、15 mL/g、20 mL/g、25 mL/g、30 mL/g、35 mL/g进行试验，结果表明，随着液料比增大，多糖提取率先是也随之增大，但当液料比增到20 mL/g后，提取率趋于稳定，所以确定液料比为20 mL/g。

2.1.4 碱浓度对碱溶性多糖提取率的影响

在试验条件为提取温度60℃、提取时间2 h、液料比20 mL/g、提取次数1次的条件下，NaOH浓度分别选择为1%、3%、5%、7%、9%、11%进行试验，结果表明，随着NaOH浓度的增大，碱溶性多糖的提取率不断地增大，但当NaOH 浓度超过5%时，由于部分多糖碱水解程度加剧，导致提取率显著降低，因此确定NaOH浓度为5%。

2.1.5 提取次数对碱溶性多糖提取率的影响

在试验条件为提取温度60℃、提取时间2 h、液料比20 mL/g、NaOH浓度5%的条件下，提取次数分别选择为1、2、3、4、5、6次进行试验，结果表明，碱溶性多糖的提取率随着提取次数的增加而增加，当提取次数超过3次后，提取率变化基本趋于稳定，故提取次数选择为3次。

2.2 正交设计试验结果与方差分析

L16(45)正交设计试验及方差分析结果见表2、表3。

由直观分析表2显示，各因素水平提取率均值最大值分别为：X1、X2和X3均为均值2，X4和X5均为均值3，即赤灵芝碱溶性多糖经过正交设计试验优化的最佳提取工艺为提取时间2 h，提取温度60℃，液料比15 mL/g，碱浓度5%和提取次数3次。极差大小顺序为：X1＞X2＞X5＞X4＞X3，表明各因素对多糖提取率的影响程度大小为提取时间最大，液料比最小，因此在提取过程中我们要严格控制好提取时间和温度。

由方差分析表3我们也可以看出，各因素的F值大小顺序为：X1＞X2＞X5＞X4＞X3，结果反映的各因素对多糖提取率影响程度大小顺序与直观分析表结果一致，同时提取时间对提取率的影响具有显著性差异(P＜0.05)。

表2 正交设计试验结果直观分析

表3 方差分析结果

2.3 验证性试验

为验证正交设计试验优化结果，以单因素试验确定的最佳水平组合为对照作验证性试验，试验重复3次。试验结果见表4。

表4 验证性试验结果(n=3)

由表4可看出，单因素试验和正交设计试验所确定的最佳提取工艺唯一的区别在于液料比的不同，从多糖提取率平均值比较，二者没有显著性差异，并且考虑到节约溶剂和能源，缩短浓缩时间，RSD值也较小，说明正交设计试验优化的赤灵芝碱溶性多糖提取工艺是稳定高效的，对生产具有一定的指导意义。

3 结论

本研究利用单因素试验和正交设计试验，分别考察了提取时间、提取温度、液料比、碱浓度和提取次数对赤灵芝碱溶性多糖提取率的影响，试验结果表明，提取时间对碱溶性多糖提取率具有显著影响(P＜0.05)，然后从大到小依次是提取温度，提取次数，NaOH浓度和水料比。

通过正交设计试验确定的赤灵芝碱溶性多糖最佳提取工艺是提取时间2 h，提取温度60℃，液料比15 mL/g，碱浓度5%和提取次数3次，验证性试验表明，该工艺条件稳定性更好，赤灵芝子实体碱溶性多糖提取率高达10.98%，与单因素试验结果基本一致，且更节约能源。因此，正交设计试验用于优化赤灵芝碱溶性多糖提取工艺是稳定可靠、切实可行的，可用于生产预测。

[1] 黄芳,蒙义丈.活性多糖的研究进展[J].天然产物研究与开发,1999,11(5):90-98.

[2] 宁安红,孙晓东,曹婧,等.灵芝多糖抗肿瘤作用的初步探讨[J].中国微生态学杂志,2003,15(6):122-116.

[3] 郑静,韩宏义,常乃涛,等.灵芝多糖提取及性质分析[J].北方园艺,2011,(06):43-45.

[4] 陈书明,聂向庭,王勤.人工培养灵芝菌丝体中免疫活性成分初探[J].山西农业大学学报,1994,14(4):429.

[5] 黄伟光,戴文英.灵芝菌的药效[J].中国食用菌,1993,12(3):15.

[6] 张立娟,于国萍.黑木耳多糖酶法提取条件的优化及脱蛋白工艺的研究[J].食品工业科技,2005,26(5):109-111.

[7] 李刚.发酵灵芝菌粉和灵芝子实体中灵芝多糖含量比较[J].中国食用菌.1999,19(1):35-36.

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ISSN.2095-6681.2016.03.0183.02