响应面法优化放线菌BOS—018的液体发酵工艺

王勇 曹艳杰 张文革

摘要：为了提高放线菌BOS-018代谢产物中有效代谢物质浓度，得到更多的活性成分，并提高其抑菌活性，采用响应面法来优化放线菌BOS-018的液体发酵条件。先通过单因素试验确定最佳单因素，再运用Plackett-Burman试验对影响发酵的几个因素进行评价并筛选出3个最主要因素，即温度、接种量和装液量。经最陡爬坡试验，最后运用Box-Behnken设计得到这3个因素的最佳值为：温度27.74 ℃，接种量13.26 mL，装液量102.07 mL。优化后，抑菌圈直径达到22.12 mm，相对于优化前提高36.7%。

关键词：放线菌；发酵优化；响应面法；Plackett-Buman试验；最快爬坡试验；Box-Behnken试验

中图分类号： TQ920.6文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0458-03

放线菌具有非常高的经济价值，能产生多种多样的抗菌物质。到目前为止，食品、工业、医药和农业上有许多成功的抗生素的使用实例[1]。从放线菌中提取有效的抗菌物质来抑制黄瓜枯萎病成为一条安全、有效的途径，放线菌BOS-018的次级代谢产物对黄瓜枯萎菌有较明显的抑制作用。放线菌发酵培养基和发酵条件的优化是工业生产中非常重要的，是从实验室到工业生产中不可缺少的环节[2]。响应面法在试验设计中是一种常用方法，准确、高效且分析性强[3-4]。本实验运用响应面法中的Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken设计来对BOS-018菌株的培养基配方和培养条件进行优化，应用Design-Expert.V.8.0.6軟件对条件进行二阶数值模型分析，获得回归方程，效果显著[5]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株供试菌株：放线菌菌株BOS-018 （从长白山针叶林土壤中分离、筛选并保存）。指示菌株：黄瓜枯萎病菌，由辽宁科技大学生物工程实验室提供。

1.1.2培养基固体保存培养基：PDA培养基；液体发酵培养基：高氏一号液体培养基。

1.2方法

1.2.1菌株的活化和抑菌物质的测定将实验室保存的BOS-018菌种接种于高氏一号斜面固体培养基上，在28 ℃恒温培养箱中培养7 d，进行菌株活化。然后用接种环将菌种从斜面培养基接到250 mL三角瓶中，三角瓶中放入液体发酵培养基，然后放置在恒温振荡器上振荡培养，振荡器温度为28 ℃，转速为140 r/min。将放线菌菌株BOS-018接种于高氏一号液体发酵培养基中进行发酵培养，根据不同的发酵培养条件培养后，将菌液在无菌条件下离心15 min，离心条件为4 000 r/min。然后把无菌滤纸片在离心所得的上清液中浸泡3 min后置于已接种黄瓜枯萎病菌的PDA培养基平板中央，于28 ℃条件下恒温培养7 d后，再分别测量抑菌圈直径，确定最佳发酵条件[6]。

1.2.2响应面法优化发酵条件

1.2.2.1单因素试验采用单因素试验依次对培养基、发酵温度、发酵时间、装液量、接种量、pH值等液体发酵工艺参数进行逐一优化。每个处理重复3次，平均3次试验的值。然后按照上面的方法对致病真菌进行抑菌试验，找到能产生最大抑菌圈的单因素发酵培养基和培养条件。

1.2.2.2Placket-Burman（P-B）设计试验[7]在单因素试验的基础上，选取N=9的P-B试验进行设计，将影响 BOS-018 发酵的9个因素作为P-B设计的主要成分。将高水平（1）设定为低水平（-1）的1.25～1.50倍，抑菌圈直径作为响应值Y。表1为P-B设计试验。数据采用 SPSS 17. 0 统计软件进行统计处理，分别对数据作单因子方差分析，以P<0.05 表示差异显著。选出影响抑菌圈直径的3个显著因子。

1.2.2.3Box-Behnken（B-B）试验设计在单因素试验及P-B试验的基础上，选取对整个发酵模型影响最大的3个显著因子进行响应面分析，利用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken试验设计，每个因素3个水平，5个重复的中心点。响应面分析试验以显著因素为自变量，以抑菌圈直径为响应值，来确定各因素对致病真菌的影响。

1.2.3[JP3]模型的验证试验为了进一步验证响应面法所得预测值，将优化后所得最佳预测值进行发酵试验，每个试验均设3个重复，取平均值。比较试验所得值和预测值，来确定采用响应面法优化得到的发酵条件是否准确可靠、是否具有实用价值。

2结果与分析

2.1Placket-Burman试验结果与分析

Placket-Burman试验数据见表2，表中数据采用SPSS 17. 0 统计软件进行统计处理后，得到各因素的主要效应和显著性，结果见表3。由表3可知，影响液体发酵的3个最显著因素分别是温度、接种量和装液量，它们的Pr值均小于005，说明这个回归模型是具有统计学意义的，这3个因素的影响都是显著的。

2.2最陡爬坡试验结果与分析

由Plackett-Burman试验能够看出，放线菌BOS-018液体发酵条件优化中温度、接种量、装液量3个因素对抗生素的产量有显著影響，其中温度和接种量有显著的正效应，应增加，装液量有显著的负效应，应减少。根据3个因素效应大小比例以及方程中各变量的系数关系设定它们的变化方向及步长进行试验[8]

2.3Box-Behnken试验结果与分析

根据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验来确定试验因素和水平。试验与结果如表5。

通过Box-Behnken设计出17组试验，见表6。按照试验所得数据进行二次多项回归拟合，预测出抑菌圈直径最大值所对应的关键因子范围[9]。

3结论

发酵培养基和培养条件的优化在微生物发酵产品产业化过程当中非常重要。Plackett-Burman （P-B） 试验设计方法在微生物发酵培养基成分的优化和发酵工艺关键参数的筛选中被广泛应用，可以快速有效地筛选出对目标值影响最大的关键因子[10-11]。

本试验运用响应面法中的Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken设计来优化放线菌BOS-018的液体发酵条件。利用Plackett-Burman设计来确定显著效应因素为培养温度、接种量和装液量。利用最陡爬坡试验来确定3个显著效应因子的变化方向和步长，Box-Behnken试验确定最优值为培养温度27.74 ℃，接种量13.26 mL，装液量102.07 mL。模型预测的抑菌圈Y值为22.12 mm，验证试验结果为23 mm，相对误差为3.82%。试验结果表明模型预测与验证试验结果基本一致，用该模型可以合理、有效地预测Y值，为进行工业化生产奠定基础。

参考文献：

[1]冯轶男，杨润清. 放线菌分离与筛选方法的研究进展[J]. 生物技术，2010，20（4）：95-97.

[2]代志凯，张翠，阮征. 试验设计和优化及其在发酵培养基优化中的应用[J]. 微生物学通报，2010，37（6）：894-903.

[3]褚以文. 微生物培养基优化方法及其 OPTI 优化软件[J]. 国外医药：抗生素分册，1999，20（2）：58-60.

[4]刘志祥，曾超珍. 响应面法在发酵培养基优化中的应用[J]. 北方园艺，2009（2）：127-129.

〖FQ（94/5。54，ZX，DY-W〗[KH4D]

[5]郝學财，余晓斌，刘志钰，等. 响应面方法在优化微生物培养基中的应用[J]. 食品研究与开发，2006，27（1）：38-41.

[6]肖怀秋，李玉珍. 海金沙草总黄酮提取工艺的响应面优化[J]. 氨基酸和生物资源，2010，34（8）：68-72.

[7]杨铭. Minitab 用于中心复合设计与数据处理[J]. 药学服务与研究，2007，7（3）：231-234.

[8]Xiao Z J，Liu P H，Qin J Y. Statistical optimization of medium components for enhanced acetoin production from molasses and soybean meal hydrolysate[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，74（1）：61-68.

[9]張荣胜，梁雪杰，刘永锋，等. 解淀粉芽胞杆菌 Lx-11 生物发酵工艺优化[J]. 中国生物防治学报，2013，29（2）：254-262.[ZK）]

[10]Li Y，Jiang H，Xu Y，et al. Optimization of nutrient components for enhanced phenazine-1-carboxylic acid production by gacA-inactivated Pseudomonas sp. M18G using response surface method[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77（6）：1207-1217.

[11]胡升，梅乐和，姚善泾. 响应面法优化纳豆激酶液体发酵[J]. 食品与发酵工业，2003，9（1）：13-17.