新加香薷饮对湿热环境下流感病毒性肺炎小鼠治疗作用的比较研究

邓力，聂娇，逄蓬，郑柯，陈孝银

暨南大学医学院中医系，广东 广州 510632

新加香薷饮对湿热环境下流感病毒性肺炎小鼠治疗作用的比较研究

邓力，聂娇，逄蓬，郑柯，陈孝银

暨南大学医学院中医系，广东 广州 510632

目的：观察比较新加香薷饮对湿热环境下流感病毒性肺炎小鼠的治疗作用。方法：42只C57BL/6J小鼠随机分成6组，正常环境组每天正常饲养，湿热环境各组人工气候箱湿热环境中饲养7天。需要病毒攻击的各组，使用FM1病毒滴鼻。药物组灌胃治疗，利巴韦林用量为0.07 g/（kg·d），新加香薷饮用量为23 mL/（kg·d）。通过小鼠体重变化、肺部组织HE染色、流式细胞术等实验，测定与比较新加香薷饮对湿热环境下流感病毒性肺炎小鼠治疗作用效果与机制。结果：湿热环境一定程度上能促进病毒感染后的炎症反应，差异有统计学意义（P＜0.05）。利巴韦林和新加香薷饮在病毒感染后具有抗炎效果，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：湿热环境对于流感病毒性肺炎具有促炎作用。新加香薷饮对湿热环境下流感病毒性肺炎小鼠具有抗病毒作用，且效果优于利巴韦林。

流感病毒性肺炎；湿热环境；新加香薷饮；动物实验；小鼠

流感病毒是一种常见呼吸道病原体，能感染大量人群和动物。其具有传播快，侵害广，变异迅速的特点。研究指出湿邪可以降低细胞免疫功能，增加机体对病原微生物的易感性，导致流感病毒发生的几率升高[1]。新加香薷饮由香薷、厚朴、金银花、连翘、扁豆花等5味药组成，功能祛湿清热，化湿和中。临床上主要用于治疗暑湿型感冒、中暑、小儿外感发热证等[2～4]。研究证实，新加香薷饮中大多药物都有抗病毒作用的活性成分[5]。本实验通过检测湿热环境与正常环境对Th/Treg 细胞亚群及其所调控免疫通路的改变比较，研究新加香薷饮抗病毒作用对T细胞免疫平衡的影响。进一步探讨中药预防和治疗流感的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级C57BL/6J小鼠42只，8周龄，雌雄各半，购于Jackson实验室。动物于无特殊病菌的恒定温度和湿度条件下饲养。

1.2 药物及试剂 FM1流感病毒鼠肺适应株为暨南大学医学院微生物与免疫学教研室提供。新加香薷饮(由香薷、厚朴、连翘、香薷各6 g，金银花、鲜扁豆花各9 g，共6味中药组成)，所有中药饮片均购于广州老百姓大药房，并煎制浓缩成含生药量6 g/mL，喂药剂量按照小鼠与人的剂量换算公式进行计算。按每鼠23 mL/天给药制备相应药物浓度。利巴韦林颗粒：50 mg×18袋，葵花药业集团(衡水得菲尔有限公司)，批准文号：国药准字 H20066463。流式细胞术所需CD4-FITC，CD25-APC，IL-17-A-PE和Foxp3-APC荧光标记抗体以及CD16/CD32抗体购买自ebioscience公司，破膜剂，PMA/Ionomycin，Monensin刺激剂为联科生物公司产品，小鼠淋巴细胞分离液为天津灏洋生物TBD公司产品。

1.3 动物分组 将42只C57BL/6J小鼠随机分成6组：正常环境组，湿热环境组，正常环境+病毒组，湿热环境+病毒组，湿热环境+病毒+利巴韦林治疗组，湿热环境+病毒+新加香薷饮治疗组。

1.4 干预方法 ①正常环境组每天正常饲养，期间自由饮食。②湿热环境各组在人工气候箱湿热环境中饲养7天，设定人工气候箱条件[温度：(33±1)℃，湿度：90%，光照度：3000Lx]，每天将小鼠放入人工气候箱内12 h，其余时间置于正常室内环境进行饲养，直至实验结束，期间自由饮食；需要病毒攻击各组，使用FM1病毒经乙醚轻度麻醉后进行滴鼻，每鼠每50 μL，连续4天。药物均在病毒攻击后48 h开始给药。共给药5天，每天2次，每次0.2 mL灌胃给药。③阳性药物利巴韦林，用量为70 mg/kg，病毒感染后48 h给药。每天2次，每次0.2 mL。④中药复方新加香薷饮，用量为20 g/ (kg·d)(含生药量)，病毒感染后48 h灌胃给药，每天2次，每次0.2 mL。

2 检测指标与方法

干预结束后断颈处死小鼠，解剖摘取气管、脾和肺进行指标检测。

2.1 肺指数 药物治疗4天后，在小鼠处死前禁食禁水8 h，称量体重。打开胸腔后摘取全肺称重，按下列公式逐个计算，肺指数=(小鼠肺重/小鼠体重)×100%。

2.2 肺部组织的光镜标本制备与HE染色 取右肺经常规多聚甲醛固定乙醇梯度脱水后，包埋，切片。在脱蜡和水化后，Harris苏木精液浸泡3～5 min，自来水冲洗后于75%盐酸乙醇中分化数秒，继续冲洗待细胞核呈蓝色，0.5%伊红水溶液1～2 min，脱水透明后在普通光学显微镜下观察组织形态结构，通过自动成像系统采集图像。

2.3 淋巴细胞分离和流式细胞术检测 无菌取小鼠脾脏组织，制作成单细胞悬液，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，细胞洗涤后调整细胞浓度为1×107/mL。具体步骤严格按照说明书操作，上机检测。

3 统计学方法

4 结果

4.1 各组小鼠一般情况比较 正常小鼠行动活跃，毛发柔顺有光泽。湿热造模后，小鼠精神萎靡，蜷缩，耸毛，呼吸急促，活动、饮食饮水量均减少，体重减轻。病毒感染造模后小鼠活动度减少，精神萎靡，反应迟钝，喜欢扎堆，蜷缩，饮食和饮水减少。8周龄小鼠平均体重(21.01±0.89)g。7天后，正常环境组小鼠体重稍有增加，为(22.16±1.53)g，与7天前比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。但7天后正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组小鼠体重下降明显，分别为(15.37± 2.12)g、(15.77±2.91)g，正常环境+病毒组与正常环境组，湿热环境+病毒组与湿热环境组小鼠体重两两比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。药物治疗后，小鼠精神恢复，毛发柔顺及其他各项表征大致恢复至正常状态。7天后湿热环境+病毒+利巴韦林治疗组，湿热环境+病毒+新加香薷饮治疗组小鼠体重分别为(17.03±2.40)g与(16.97±1.73)g，但该2组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

4.2 肺指数检测 正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组小鼠肺组织的体积和重量均高于正常环境组与湿热环境组，而正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组小鼠体重较正常环境组减轻，故采用肺组织与体重的比值即肺指数来分析更准确，肺指数升高代表肺部渗出更严重。FM1病毒感染4天后湿热环境+病毒组小鼠的肺指数为1.48±0.3，相较于湿热环境组，差异有统计学意义(P＜0.05)，湿热环境+病毒+新加香薷饮治疗组肺指数为1.12±0.4，相较于湿热环境+病毒组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

4.3 肺组织病理学改变 正常环境组与湿热环境组小鼠肺泡大小较一致，支气管上皮完整，外周未见炎性细胞浸润；湿热环境+病毒+利巴韦林治疗组、湿热环境+病毒+新加香薷饮治疗组肺组织形态结构较为完整，肺泡间隔较薄，肺泡壁和细支气管壁单个核细胞浸润数量减少，腔内无渗出。正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、细支气管等正常的组织结构扭曲、紊乱程度更为严重，支气管壁上皮明显脱落，结缔组织增生，肺间质可见大量中性粒细胞浸润，肺部血管内充血严重，支气管腔内可见渗出物，见图 1。

图1 各组肺组织病理学变化 (HE，20×)

4.4 流式细胞术检测 提取淋巴细胞，依据前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)，对淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞进行分离，根据各种激发荧光分别设门。设门完成后，分别对Th17和Treg所占比例进行分析，见表1。数据显示，正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组Th1和Th17表达量上升，差异有统计学意义(P＜0.05)，且湿热环境+病毒组变化更为明显，与正常环境+病毒组比较，差异亦有统计学意义(P＜ 0.05)。经过治疗后，湿热环境+病毒+利巴韦林治疗组与湿热环境+病毒+新加香薷饮治疗组Th1、Th2、Th17、Treg相较于湿热环境+病毒组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。湿热环境+病毒感染+利巴韦林治疗组与湿热环境+病毒+新加香薷饮治疗组之间表达量比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 Th17和Treg在CD4+T细胞中的比例() %

表1 Th17和Treg在CD4+T细胞中的比例() %

与正常环境组比较，①P＜0.05；与湿热环境组比较，②P＜0.05；与湿热环境+病毒组比较，③P＜0.05

组别正常环境组湿热环境组正常环境+病毒组湿热环境+病毒组湿热环境+病毒+利巴韦林治疗组湿热环境+病毒+新加香薷饮治疗组T h 1 2 3 . 0 ± 1 . 3 1 1 7 . 0 8 ± 3 . 8 0 3 9 . 0 1 ± 0 . 7 5①③4 5 . 4 5 ± 8 . 2 4②2 8 . 7 4 ± 0 . 7 5②③2 7 . 0 8 ± 3 . 8 0②③T h 2 2 . 4 ± 0 . 5 4 5 . 2 0 ± 0 . 0 5 3 . 0 2 ± 0 . 3 0①1 . 9 3 ± 0 . 4 4②5 . 5 5 ± 1 . 6 6②③5 . 2 0 ± 0 . 1 3②③T h 1 7 1 . 5 5 ± 0 . 2 7 1 . 6 2 ± 0 . 3 4 4 . 6 1 ± 0 . 6 5①③5 . 0 2 ± 0 . 3 5②2 . 9 3 ± 0 . 4 4②③2 . 5 9 ± 0 . 4 2②③T r e g 5 . 4 4 ± 0 . 7 7 6 . 3 ± 0 . 8 1 2 . 8 7 ± 0 . 8 8①2 . 1 2 ± 0 . 7 7②4 . 0 4 ± 0 . 8 0②③4 . 5 4 ± 1 . 3 4②③

4.5 Th1/Th2和Th17/Treg比值数据情况 见图2。数据结果显示，与正常环境组与湿热环境组比较，Th1与Th17细胞的数量在正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组中呈现升高趋势，差异均有统计学意义(P＜0.05)，Th2和Treg的表达量呈现降低趋势，差异均有统计学意义(P＜0.05)，因此，与正常环境组及湿热环境组比较，正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组中的Th1/Th2的比例呈现升高趋势。湿热环境+病毒+利巴韦林治疗组与湿热环境+病毒+新加香薷饮治疗组，相较于湿热环境＋病毒组，Th1和Th2都呈现出降低趋势，且差异均有统计学意义(P＜0.05)，Th17和Treg的变化一致，都呈现出上升趋势，且差异有统计学意义(P＜0.05)。

图2 Th1/Th2和Th17/Treg比值数据

5 讨论

初始CD4+T细胞在不同的细胞因子诱导下，表达不同的转录因子，分化成为功能及表型不同的效应性Th细胞(Th1、Th2和Th17)和调节性T细胞(Treg)[6]。Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子，参与细胞免疫；在流感病毒感染后，Th1细胞分泌多种细胞因子，IFN-γ可干扰病毒复制，可特异性杀伤病毒感染细胞，表现为急性一过性炎性反应[7]。TNF-α作为重要的致炎细胞因子，其在流感病毒感染过程中对肺脏具有强烈的毒性[7～8]。IL-3可诱导机体体液免疫应答，产生抗体以中和病毒，还可促进嗜酸粒细胞的细胞毒作用，起到清除病毒的作用[9]。而Th2细胞主要分泌v IL-4、IL-5和IL-10等细胞因子，介导体液免疫，Th1细胞与Th2细胞之间存在动态平衡。Th17与Treg细胞的分化相互抑制，在功能上也呈负性调节，IL17在感染和损伤早期可有效介导促炎症反应，在病毒感染早期，包括IL-17在内的多种细胞/趋化因子都会升高，说明IL-17在流感病毒早期感染阶段起到了关键性的调节作用[10]。而Treg作为一类具有免疫调节功能的T细胞亚群具有独特的免疫特征，主要介导免疫抑制反应，通过T细胞受体信号刺激活化后引起辅助性T细胞Th1/Th2的漂移,进而影响炎症结局[11]。因而二者的平衡关系主要是调控机体的炎性反应。

前期研究发现，湿邪环境能够抑制TLR7和RLRs信号通路的活化，下调Th1/Th2和Th17/Treg的比例，导致促炎作用增强而机体免疫抑制功能受到抑制，致使无法启动正常免疫应答，使得湿邪致病缠绵难愈[12]。本实验结果显示，正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组的Th1和Th17表达量上升，而湿热环境+病毒组变化更为明显，与正常环境+病毒组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。而湿热环境+病毒组Th2、Treg与湿热环境组比较，升高明显。比较Th1/Th2、Th17/Treg比值发现，正常环境+病毒组与湿热环境+病毒组的Th1/Th2和Th17/Treg比值呈现升高趋势，提示病毒感染导致向Th1和Th17的方向转化，且湿热环境+病毒组比值更高，提示湿热合并病毒感染促使机体炎性反应增强，而抑制炎性的功能减弱。

新加香薷饮、利巴韦林对小鼠流感病毒性肺炎显示出了非常好的治疗作用，与湿热环境＋病毒组相比较差异有统计学意义(P＜0.01)。但临床上患者感染病毒多是出现了肺炎症状后才治疗，尽管利巴韦林对病毒扩增具有明显的抑制效果，但是在流感病毒感染后，病毒已经不是疾病的主要原因，所以直接抑制病毒扩增往往不能奏效。新加香薷饮作为中医治疗外感的三大经典方药，经大量临床验证显示出，其具有良好的抗病毒作用[3，5，13]。病理切片显示新加香薷饮组的肺组织形态结构较为完整，病变相较于病毒组更轻，提示新加香薷饮能通过病毒所致的炎症级联反应的抑制起治疗作用。

综上所述，我们认为，湿热环境对小鼠病毒感染后免疫识别具有影响，在一定程度上能促进病毒感染后的炎症反应。在新加香薷饮复方体内实验中，我们认为其在病毒感染后的抗炎效果与对甲流病毒引起的肺炎的治疗效果优于利巴韦林组。但新加香薷饮复方抗流感病毒机制仍不十分明确，有待进一步研究。

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（责任编辑：刘淑婷）

R285.5

A

0256-7415（2016）02-0235-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.091

2015-10-20

广州市科技计划（2014J4100106）；广东省科技计划（2014A020212221）；广东省自然科学基金（S2013010013434）；国家自然科学基金项目（81473557）

邓力（1990-），男，博士研究生，研究方向：中医外感病因学研究。

陈孝银，E-mail：tchenxiaoyin@jnu.edu.cn。