高效液相法测定盐酸小檗碱片含量的不确定度评定

陈　丽

（河南省开封市食品药品检验所，开封　475000）



高效液相法测定盐酸小檗碱片含量的不确定度评定

陈丽

（河南省开封市食品药品检验所，开封475000）

摘要：目的建立以高效液相法测定盐酸小檗碱片含量的不确定度评定的方法。方法通过对各分量的分析，计算各分量的不确定度，最后计算出合成标准不确定度及扩展不确定度。结论本文所建立的方法可用于该制剂的不确定度的评定。关键词：高效液相色谱法；不确定度；评定；盐酸小檗碱片；含量测定

不确定度是表征被测量物质真值所处的量值范围的评定结果，是对实验测量结果的可信度评定，随着人们对中药质量要求的进一步提高，对检验结果的可靠性要求也在不断提高，不确定度的测量也被大家所重视，本文用高效液相色谱法测定盐酸小檗碱片含量，并根据《化学分析中不确定度的评估指南》CNAS—GL06有关规定对其含量的测定不确定度进行评定。

1　实验部分

1.1仪器与试药岛津LC-2010C高效液相色谱仪；Sartorius CP225D分析天平、Agela Promosil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm粒径5 μm）、紫外检测器、水为去离子纯化水、盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所、批号：110713-200911含量：86.8%）、分析纯磷酸二氢钾、庚烷磺酸钠、色谱纯乙腈。

1.2色谱条件用十八烷基硅烷基键合硅胶为填充剂；用磷酸盐缓冲溶液-乙腈（60∶40）作为流动相、进样量：10 μl、柱温：36℃、紫外检测器检测波长：263 nm、流速：1 ml/min。

1.3对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品约10 mg，精密称定，置250 ml量瓶中，加沸水溶解，放冷，用水稀释至刻度（制成每1 ml中约含盐酸小檗碱40 μg的溶液），摇匀。

1.4供试品溶液的制备取本品20片，精密称定，置100 ml量瓶中，加沸水适量使盐酸小檗碱溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml置50 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取上述两种溶液各10 μl进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。

2　结果

2.1数学模型①含量测定不确定度：在实际操作中，对照品精密称取2份，每份经稀释后进样3次，经过回归计算确定校正系数f值，同时精密称取供试品2份，每份经稀释后进样2次，根据峰面积由校正系数f求得浓度值，以浓度平均值求得供试品的百分含量。根据药典规定，含量计算公式为：X= (f×AT×M×mR×1/VR) /(Ai×mT×1/ VT1×VT2/VT3×50×1000)。X为盐酸小檗碱占标示量的百分含量（%）；f为校正系数；AT为供试品溶液色谱峰面积；M为盐酸小檗碱的平均片重；mR为对照品称样量；1/VR为对照品的稀释倍数；Ai为对照品溶液色谱峰面积；mT为供试品的称样量；1/VT1×VT2/VT3为供试品的稀释倍数，50为盐酸小檗碱的规格。②称量带入的不确定度：根据天平附带资料，天平的分辨率为0.01 mg，按矩形分布计算（k=31/2），则称量不确定度u (m1) =0.01×10-3/31/2=5.8× 10-6g，天平称量重复性误差为0.02，则重复性带入的不确定度u (m2) =0.02×10-3/31/2=1.15×10-5g。天平的标准不确定度（u(m)=（u(m1)2+ u(m2)2）1/2=1.29×10-5。③玻璃仪器的不确定度：本法使用仪器为250 ml、100 ml、50 ml量瓶及5ml移液管，250 ml量瓶容量允差为±0.1 ml；100 ml量瓶容量允差为±0.1 ml；50 ml量瓶（A级）容量允差为± 0.05 ml，5 ml移液管容量允差为±0.015 ml。按三角分布计算（k=61/2），则250 ml、100 ml量瓶校正带入的不确定度urel(V1) urel(V4)分别为0.10/61/2=0.0408；50 ml量瓶校正带入的不确定度urel(V2)为0.05/61/2=0.0204 ml，5 ml移液管其标准不确定度urel(V3)为0.015/61/2=0.00612 ml。温度：实验室温度在（20±3）℃范围内波动，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，假设为均匀分布，其标准不确定度分别为2.1×10-4×3×100/31/2=0.00115；2.1×10-4×3×50/ 31/2=0.00182；2.1×10-4×3×5/31/2=0.00182 2.1×10-4×3×250/ 31/2=0.0909。以上两种分量合成得：urel(V1)（0.04082+ 0.001152）1/2=0.00424。urel(V2)（0.02042 +0.001822）1/2= 0.00273。urel(V3)（0.0006122+0.001822）1/2=0.000638。urel(V4) （0.04082+0.09092）1/2=0.0996。

2.2对照品溶液的相对不确定度urel(A1)对照品称样u (RM)和溶液色谱峰面积u (A1)引起的不确定度。两份对照品称样分别为0.01098 g和0.01082 g；称样的相对标准不确定度：u(RM)=【（u(m)/0.01098）2+（u(m)/0.01082）2】1/2=0.00167。两份对照品溶液分别进样3次，重复测量的峰面积分别为：A1：2549410、2548394、2549145和A2：2538467、2539613、2539306 u (RA)的产生主要由重复性进样引起，由仪器给出的进样峰面积标准偏差为随机测量，按每一次的重复次数n=3，用A1的RSD计算其标准不确定度。A1的RSD值为0.0207%。对照品溶液色谱峰面积引起的不确定度u (A1) = RSD/31/2=0.000120。盐酸小檗碱对照品含量为86.6%，未提供不确定度，则将其视为真值，引入的不确定度为0。合成：urel(A1)=[ u(RM)2+ urel(V4)2+ u(A1)2]1/2=0.0996。

2.3供试品溶液的相对不确定度分别称取两份供试品分别为0.3723g和0.3738g，供试品称量相对标准不确定度= u(TM)=【（u(m)/0.3723）2+（u(m)/0.3738）2+（u(m)/1.4068）2】1/2=4.97×10-5。两份供试品溶液分别进样3次，重复测量的峰面积分别为：Y1:2348211、2348250、2348267和Y2：2342437、2342468、2342483用Y1的RSD计算其标准不确定度。Y1的RSD为：0.00122%。供试品溶液色谱峰面积引起的不确定度u (Y1) = RSD/31/2=7.04×10-6。合成：urel(Y1)=[ u(TM)2+ urel(V2)2+ urel(V3)2+ u(Y1)2]1/2=0.00694。

3　合成不确定度U (x)

urel(X)=[ urel(Y1)2+ urel(A1)2]1/2=0. 326。实验中测得x= 96.00%。U (x) = urel(X)×x=0. 326×96.00%=0.31%。实验结果一般以扩展不确定度来表示，取包含因子k=2 (置信概率为95%)，则含量测定扩展不确定度U=k×U (x) =2×0.31% =0.62%则含量测定结果可表示为96.00%±0.62%（k=2）。

4　总结

药品检验结果是判定药品是否合格的重要依据，《中国药典》对于不确定度的评定没有明确要求，但实际上在药品检验工作中推行不确定度的评定有一定价值，它为评价分析方法、评定实验室及检测人员的技术水平和药品质量的准确判定都提供了较为客观的依据。

本文通过对盐酸小檗碱含量测定过程中各步骤不确定度的评定得出最后测量结果为96.00%±0.62%，测量结果真实反映了实验室日常检验结果的水平。

Evaluation of Uncertainty Measurement in Content Determination of Berberine Hydrochloride by HPLC

CHEN Li
(Kaifeng Institute for Food and Drug Control, Henan Province, Kaifeng 475000, China)

Abstract:Objective To establish a method for the evaluation of the uncertainty in the content determination of berberine hydrochloride by HPLC. Methods Each components of uncertainty was calculated by analyzing the various variable parameters among the procedures. The combined standard uncertainty and the expanded uncertainty were then finally obtained by synthesizing the uncertainties of various component variables. Conclusion The method of the evaluation of uncertainty measurement established in this paper is reasonable and reliable.

Keywords:HPLC; uncertainty; evaluation; berberine hydrochloride; content determination

收稿日期：（本文编辑：张文娟本文校对：张文娟2016-01-08）

doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2016.06.067

文章编号：1672-2779（2016）-06-0138-03