UPLC-ESI-QTOF-MS检测巴西龟龟甲胶中牛皮特征肽的研究＊

唐 敏，严建业，2，赵小芳，徐 博，王学生，李顺祥，2＊＊

（1. 湖南中医药大学药学院 长沙 410208；2. 湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心长沙 410208；3.山东一笑堂阿胶集团百年制药有限公司 新蔡 463500）

UPLC-ESI-QTOF-MS检测巴西龟龟甲胶中牛皮特征肽的研究＊

唐 敏1，严建业1，2，赵小芳1，徐 博1，王学生3，李顺祥1，2＊＊

（1. 湖南中医药大学药学院 长沙 410208；2. 湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心长沙 410208；3.山东一笑堂阿胶集团百年制药有限公司 新蔡 463500）

目的：以巴西龟为来源的龟甲胶中牛皮特征肽成分的检测。方法：采用胰蛋白酶进行酶解，利用超高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱法分别对以巴西龟为来源的龟甲胶和以中华草龟为来源的龟甲胶进行测定，选定牛皮特征肽离子m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8作为检测对象。结果：巴西龟来源的龟甲胶中只检测出牛皮特征肽离子m/z 641.3信号，其MS/MS裂解规律与黄明胶标准品酶解产物所含牛皮特征肽GEAGPSGPAGPTGAR一致，而中华草龟来源的龟甲胶中均未检测出牛皮特征肽信号。结论：该方法专属性强，灵敏度高，可区别巴西龟龟甲胶和掺杂牛皮成分的龟甲胶，可用于龟甲胶的质量控制。

超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆飞行时间质谱 牛皮特征肽 巴西龟龟甲 龟甲胶

龟甲胶是龟科动物乌龟的背甲及腹甲经水煎煮、浓缩制成的固体胶，历版《中国药典》均有收载，是中国名贵中药[1]，其味甘、咸，性平，归肝、肾经，可滋阴，补血，主治阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄等症。中华草龟龟甲入药在中国已有数千年历史，近年来由于其价格昂贵，草龟被过度捕杀，造成其资源面临严重匮乏。一些厂家为了节省成本，利用其它动物甲壳和皮革为原料来生产龟甲胶，其中包括以巴西龟龟壳和掺杂牛皮为原料的情况。巴西龟（Trachemys scripta elegans）又名红耳龟[2]，原产于美洲，因其适应性强、食性广且生长繁殖迅速、大量掠夺同类物种的生存资源，而被列为世界上最危险的入侵物种之一[3]。巴西龟对生态具有一定的破坏性，但资源极其丰富，价格也相对低廉。在中国，巴西龟于20世纪80年代经香港被引入内陆[4]，其养殖遍及中国中南部的所有省区，相关贸易则遍布全国所有省份[5]。根据市场调查统计结果[6]，巴西龟龟甲的市场占有率高达38%，仅次于中华草龟。实际检测中发现，巴西龟龟甲胶与中华草龟龟甲胶酶解产物中龟甲特征肽的含量相差不大。同时，也有报道显示巴西龟龟甲胶同样具有较好的滋阴作用[7，8]，有学者推测巴西龟有可能部分替代药典草龟成为制备龟甲胶的原料。

胶类药材是指由动物的皮革、骨骼等加工而成的胶原蛋白水解肽[9]。根据不同动物的同类型胶原蛋白的氨基酸序列存在差异[10]，其胰蛋白酶水解产物所含肽段之间即存在差异性。近年来，利用LC-MS技术对不同胶类酶解产物的特征肽段进行分析的方法日趋成熟[11，12]，而被广泛用于胶类制剂的检测。以牛皮为原料熬制的胶类称之为黄明胶，据相关文献报道[13-15]，黄明胶经过胰蛋白酶水解后产生的多肽离子中，m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8具有特征性。2015版《中国药典》标准规定了采用HPLC-MS对龟甲特征肽进行定性检测，但未对其他掺杂胶类予以说明。国家食品药品监督管理总局（CFDA）已出台的补充检测方法批件（批件号：2014013）对龟甲胶中是否掺杂牛皮成分有所要求，该方法采用HPLC-MS联用技术对龟甲胶样品酶解产物中的牛皮特征肽离子m/z 641.3进行定性和定量检测。但是，在实际检测工作中发现，以巴西龟为原料的龟甲胶样品中可检测出牛皮特征肽离子m/z 641.3的信号[16]。鉴于巴西龟龟甲胶酶解产物和掺杂黄明胶的龟甲胶酶解产物中均可检测出牛皮特征肽离子m/z 641.3的信号，现行的标准不能很好区别以上两者。因此，为了区别巴西龟龟甲胶和掺杂牛皮成分的龟甲胶，对除m/z 641.3以外的其他牛皮特征肽离子进行检测显得尤为必要。

1 仪器与试药

Waters Acquity超高效液相系统（美国Waters公司）；Waters-Xevo-G2-QTOF质谱系统（美国Waters公司）；ACQUITY UPLC-BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Waters公司）。Mettler MS205DU型电子分析天平（瑞士Mettler公司）；KQ 5200型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；ELGA PURELAB OPTION-R 7超纯水仪（英国ELGA公司）。

亮氨酸脑啡肽（美国Waters公司，批号：700008842-1）；甲 酸（德 国CNW公 司，批 号：N030K060）、乙腈（色谱纯，德国Merck公司，批号：1746030430）；序列分析级胰蛋白酶（美国Promega公司，批号：00001714876）；NH4HCO3（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20150119）；龟甲胶对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121693-201301）；黄明胶对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121695-201301）。

本实验所用龟甲胶样品均为实验室按照相关胶类药材的生产工艺自行制得，样品共计4份，其原料分别是干巴西龟龟壳、活巴西龟龟壳、干草龟龟壳、活草龟龟壳。

表1 不同原料龟甲胶供试品牛皮特征肽成分的检测结果

2 方法与结果

2.1 液相条件

流动相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱（0-25 min，5% B→20% B；25-40 min，20%B→50%B；40-41 min，50%B→ 99% B；41-42 min，99% B；42-43 min，99%B→5%B；43-45 min，5%B）；流速为0.3 mL·min-1；柱温为40℃；进样量为1 μL。

2.2 质谱条件

离子化模式为ESI+，毛细管电压为3 kV，锥孔电压为40 V，除溶剂温度为450℃，除溶剂气体为600 L·h-1。离子源温度为120℃。采用MSE和MS/ MS方式进行数据采集，采集时间为45 min，扫描范围为100-1 500 amu，扫描时间为0.2 s。锥孔电压40 V。碰撞能量：MSE方式低能量为4 V，梯度高能量为20-30 V；MS/MS方式碰撞能量为25 V。碰撞气体为高纯氩气。

2.3 供试品溶液制备

在选择酶解时间方面，本研究考察的酶解时间为12、16、18 h，因各组试验结果差异不大，故最终选定酶解时间为12 h。

分别称取原料为干巴西龟龟甲、活巴西龟龟甲、干草龟龟甲、活草龟龟甲的龟甲胶样品各0.1 g，分别置于50 mL量瓶中，加1% NH4HCO3溶液超声溶解并稀释至刻度，过0.22 μm的微孔滤膜，取连续滤液100 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析纯胰蛋白酶适量，加1%NH4HCO3溶液溶解，制成每1 μL中含1 μg胰蛋白酶的溶液）10 μL，摇匀，37℃恒温酶解12 h，制得供试品溶液1、2、3、4。

2.4 对照品溶液制备

分别称取龟甲胶标准品和黄明胶标准品各0.1 g，分别置于50 mL量瓶中加1% NH4HCO3溶液超声溶解并稀释至刻度，过0.22 μm的微孔滤膜，取连续滤液100 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析纯胰蛋白酶适量，加1% NH4HCO3溶液溶解，制成每1 μL中含1 μg胰蛋白酶的溶液）10 μL，摇匀，37℃恒温酶解12 h，制得对照品溶液5、6。

2.5 牛皮元特征峰的确认

黄明胶标准品酶解溶液中可检测出牛皮特征肽离子m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8，巴西龟龟甲胶样品酶解溶液中可检测到牛皮特征肽离子m/z 641.3，检测结果见表1，质谱提取离子峰见图1。根据检测结果，中华草龟龟甲胶样品酶解溶液中未检测到牛皮特征肽离子。并对巴西龟龟甲胶酶解溶液中检测到的牛皮特征肽离子m/z 641.3进行二级质谱分析，得出其MS/MS裂解规律与黄明胶标准品酶解产物所含牛皮特征肽GEAGPSGPAGPTGAR完全一致[17]，相关质谱裂解数据见图2。

2.6 精密度考察

取干巴西龟龟甲胶制得的供试品溶液，以m/z 604.8和m/z 790. 8共2个牛皮特征肽提取离子峰作为检测检测对象，连续测定6次，结果的RSD分别为1.37%和1.95%（n=6），表明本方法精密度良好。

图1 巴西龟龟甲胶、黄明胶牛皮特征肽提取离子峰

2.7 稳定性考察

取干巴西龟龟甲胶制得的供试品溶液，以m/z 790.8和m/z 604.8共2个牛皮特征肽提取离子峰作为检测对象，分别于0、2、4、6、8、10 h测定，结果2个特征峰均可被检出，平均保留时间分别为5.17 min和13.10 min，RSD为1.35%和1.40%，说明供试品溶液在10 h内均可满足稳定性需要。

图2 巴西龟龟甲胶和黄明胶标准品酶解产物m/z 641.3 MS/MS裂解质谱图

3 讨论

《中国药典》收录的龟甲胶来源为中华草龟，但因其资源面临枯竭，势必需要寻找其它代用品。巴西龟生命力顽强而又极易饲养，推测其有可能部分替代药典草龟成为生产龟甲胶的原料。现行的龟甲胶检测补充批件规定，原材料是否掺杂牛皮的检测指标为牛皮特征肽离子m/z 641.3。根据本研究对巴西龟龟甲胶酶解样品中检测到的m/z 641.3离子进行了二级质谱裂解分析，其裂解规律与黄明胶标准品酶解产物所含牛皮特征肽（GEAGPSGPAGPTGAR）一致[17]，故巴西龟龟甲胶酶解产物中也可检测出该特征肽信号。如果巴西龟可作为中华草龟的替代品来制备龟甲胶，那么现行的检测方法就不能很好区别巴西龟龟甲胶和掺杂黄明胶的龟甲胶。根据本课题组的检测结果，黄明胶酶解产物中已发现的另外两个牛皮特征肽离子m/z 604.8和m/z 790.8，在巴西龟龟甲胶酶解产物检测不到。因此，本研究建议利用m/z 604.8和m/z 790.8两个特征肽离子为检测指标，该方法可以很好地区别巴西龟龟甲胶和掺杂黄明胶的龟甲胶。

参考文献

1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部). 北京:中国医药科技出版社,2015:181.

2 刘丹,史海涛,刘宇翔,等. 红耳龟在我国分布现状的调查. 生物学通报, 2011, 46(6): 18-21.

3 Lowe S M, Browne M, Boudjelas S, et al. 100 of the World's Worst Invasive Alien Species: A Selection From the Global Invasive Species Database, 2000,12.

4 史海涛,龚世平,梁伟,等. 控制外来物种红耳龟在中国野生环境蔓延的态势. 生物学通报, 2009, 44(4):1-3.

5 Shi Haitao, James F. Parham, Fan Zhiyong, et al. Evidence for the massive scale of turtle farming in China. Oryx, 2008, 42(1):147-150.

6 兰志琼,卢先明,蒋桂华, 等. 我国四大药材专业市场龟甲药材的初步调查. 成都中医药大学学报, 2012, 35(1):34-36.

7 顾迎寒,卢先明,蒋桂华,等. 不同品种龟甲滋阴作用的对比研究.时珍国医国药, 2007, 18(6):1417-1418.

8 陈前进,余东方,冯淡开. 龟甲现代研究概况. 海峡药学, 2009, 21(6):105-106.

9 Karim A A, Bhat R. Fish gelatin: properties, challenges, and prospects as an alternative to mammalian gelatins. Food Hydrocolloids, 2009, 23(3):563-576.

10 Nemati M, Oveisi M R, Abdollahi H, et al. Differentiation of bovine and porcine gelatins using principal component analysis. J Pharma Biom Anal, 2004, 34(3):485-492.

11 刘荣霞,果德安,叶敏,等. 液质联用技术(LC/MS)在中药现代研究中的应用. 世界科学技术—中医药现代化, 2005,7(5):33-40.

12 Yilmaz M T, Kesmen Z, Baykal B, et al. A novel method to differentiate bovine and porcine gelatins in food products: NanoUPLC-ESI-Q-TOFMS E, based data independent acquisition technique to detect marker peptides in gelatin. Food Chem, 2013, 141(3):2450-2458.

13 程显隆,李文杰,张小龙,等. UPLC-QTOF-MS结合主成分分析法用于龟甲胶、鹿角胶中添加牛皮源成分的检测研究. 药物分析杂志, 2012(6):931-935.

14 Cheng X L, Wei F, Xiao X Y, et al. Identification of five gelatins by ultra performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS) using principal component analysis. J Pharm Biomed Anal, 2012, 62:191-195.

15 Li W J, Shi Y, Wei F, et al. Identification of bovine-hide gelatin from glue of tortoise shell and deer-horn gelatin by UPLC-QTOF-MS and principal component analysis. Chin J Pharm Anal, 2012, 32(6):931-935.

16 彭婷婷,江勋. 超高效液相色谱-质谱联用法检测不同品种龟甲制龟甲胶的牛皮源成分. 中国药业, 2016, 25(10): 72-73.

17 程显隆. 胶类药材质量控制关键技术研究. 北京:北京中医药大学博士学位论文, 2014.

Identification of Bovine Hide Gelatine from the Shell Glue of the Red-Eared Slider (Trachemys scripta elegans) Using UPLC-ESI-QTOF-MS

Tang Min1, Yan Jianye1,2, Zhao Xiaofang1, Xu Bo1, Wang Xuesheng3, Li Shunxiang1,2
(1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Hunan Province Engineering Research Center of Bioactive Substance Discovery of Traditional Chinese Medicine, Changsha, 410208, China; 3. SHANDONG YIXIAOTANG EJIAO GROUP BAINIAN ZHIYAO CO,.LTD, Xincai 463500, China)

This study aimed at developing an ultra-performance liquid chromatography electrospray time of flight-mass spectrometry (UPLC-ESI-QTOF-MS) method for the identification of bovine hide gelatine from the shell glue of the red-eared slider. Tortoise shell glue was made from the shell of red-eared slider or Reeves' turtle (Chinemys reevesii). The samples were analyzed on UPLC-ESI-QTOF-MS after being digested by trypsin, and the ions at m/z 604.8, m/z 641.3, m/z 790.8 of the marker peptides of bovine hide gelatin were detected. As a result, it was found that the test results of the ions made from the shell of red-eared slider at m/z 641.3 were positive, taking the same fragmentation regularity of MS/MS as the standard of bovine-hide gelatine, while negative results were detected from the ions made from the shell of Reeves' turtle. In conclusion, the method was simple and accurate provided a basis for distinguishing the tortoise shell glue from bovine hide, which could be also used for the quality control of tortoise shell glue.

Ultra-performance liquid chromatography electrospray time of flight-mass spectrometry, the marker peptides of bovine hide gelatine, the shell of Trachemys scripta elegans, tortoise shell glue

10.11842/wst.2016.12.024

R284

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-11-13

修回日期：2016-12-10

＊ 国家中医药管理局“药用植物学”重点学科课题（国中医药发[2009]30号），负责人：李顺祥；湖南省教育厅“中药学”重点学科（湘教通[2011]76号），负责人：李顺祥；湖南省教育厅高校科技创新团队（湘教通[2010]212号），负责人：李顺祥。

＊＊ 通讯作者：李顺祥，本刊编委，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：中药成分与资源研究。