南方红豆杉提取物的抗氧化、抗肿瘤活性研究

刘 茜， 张 业

(1. 广西师范大学化学与药学学院，广西桂林541004；2. 桂林师范高等专科学校化学与药学系，广西桂林541001)

南方红豆杉提取物的抗氧化、抗肿瘤活性研究

刘 茜1， 张 业2

(1. 广西师范大学化学与药学学院，广西桂林541004；2. 桂林师范高等专科学校化学与药学系，广西桂林541001)

南方红豆杉；紫杉醇；抗氧化活性；抗肿瘤活性；超声波提取

延缓衰老、防癌抗癌是目前人们高度关注的健康问题，寻求与开发高效低毒的抗氧化剂和抗肿瘤药物是当前的研究热点。研究表明，自由基和活性氧在癌症发生的病理过程中具有重要的调节作用[1-3]，而抗癌药物在发挥作用的过程中也往往涉及一些抗氧化作用机制[1-2]，因此科学家们认为抗氧化作用机制和抗癌作用机制之间存在密切的联系[1-3]，故研发兼具抗氧化活性和抗肿瘤活性的药物对延缓衰老和防癌抗癌具有重要的意义。在强调绿色、健康的当今社会，从天然植物中筛选高效、低毒的抗氧化剂和抗肿瘤药物无疑是一种合理的策略。

南方红豆杉Taxuschinensisvar.mairei又称美丽红豆杉，为红豆杉科Taxaceae乔木或灌木，是我国特有一级重点保护珍稀植物，主要分布于长江流域、南岭山脉山区及福建、台湾、浙江和广西一带。红豆杉始载于《本草纲目》，可用于治疗霍乱、伤寒和排毒。在《中药大辞典》和《本草推陈》中也有关于红豆杉用于治疗通经止痛、利尿、降血糖等的相关记载。自从20世纪70年代初，美国天然产物化学家Wani等[4]从红豆杉树皮中分离得到具有广谱抗癌作用的紫杉醇以来，南方红豆杉受到了人们的高度关注。研究表明，紫杉醇在发挥抗癌作用的过程中涉及到氧化应激过渡态的发生[5-7]，故我们推测紫杉醇可能具有良好的抗氧化活性。本文采用乙醇对南方红豆杉进行提取，然后进一步通过柱色谱法分离得到紫杉醇，并对南方红豆杉乙醇提取物和紫杉醇的抗氧化活性以及抗癌活性进行研究，旨在为进一步拓展南方红豆杉和紫杉醇的药用价值提供指导。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

南方红豆杉树枝2011年11月采自桂林师范高等专科学校植物园，晾干，粉碎。样品由桂林医学院药学院黄德青老师鉴定为南方红豆杉TaxusChinensisvar.mairei。

本实验所用水均为二次蒸馏水；DPPH·、ABTS+·和紫杉醇标准品购于Sigma公司；人非小肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞Bel7402和子宫颈癌细胞Hela购于上海拜力生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

HB-402V超净工作台(韩国Hanbeak科学株式会社)；PM-10AK倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；MCO96二氧化碳培养箱(日本三洋电机株式会社)；Elx800酶标仪(美国Bio Tekinstruments公司)；KQ5200-B型超声波清洗机(郑州南北仪器设备有限公司)；RE-520旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；AR-1140/C 型电子分析天平(美国Ohaus 公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；DJ-10A灵巧型粉碎机(上海隆拓仪器设备有限公司)。

1.2 南方红豆杉提取物和紫杉醇的制备

称取200.0 g南方红豆杉粉末溶于无水乙醇中，80 ℃恒温超声提取2 h，抽滤，滤液50 ℃减压浓缩后得40.6 g棕色提取物EE，收率20.3%。

用氯仿萃取提取物EE，根据文献[7]，将得到的萃取物以氯仿-甲醇混合液为洗脱剂过柱分离，得白色晶体紫杉醇4.06 mg，收率0.002 03%，实验获得的紫杉醇与标准品的TLC的Rf值一致，M.p. 216～218 ℃。

1.3 提取物EE和紫杉醇紫外吸收的测定

以氯仿为溶剂将提取物EE和紫杉醇分别配制成1 mg/L的溶液，采用TU-1901双光束紫外可见分光光度计扫描提取物EE和紫杉醇溶液的紫外吸收图(图1)。

图1 提取物EE及紫杉醇的紫外吸收图Fig.1 UV/vis spectrums of EE and taxol

1.4 提取物EE和紫杉醇自由基清除活性的测定

SC%=[A0-(AX-AX0)]/A0×100%，

(1)

式中，A0为空白对照液吸光度，AX为加入样品液后的吸光度；AX0为样品本身的吸光度。分别测试各溶液在自由基最大吸收波长下的吸光度，并绘制自由基清除率对提取物溶液浓度曲线，计算提取物清除自由基50%时的质量浓度(IC50)。在相同测定条件下，采用抗氧化剂2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)作为对照品进行试验。BHT、EE和紫杉醇清除自由基的活性见表1。

表1 提取物EE和紫杉醇对自由基的半清除浓度IC50值

注：1.同组每系列数据之间比较差异有显著性意义(P<0.05)。

1.5 提取物EE和紫杉醇抗肿瘤活性的测定

每孔移取180 μL(4 500～5 000个细胞)含癌细胞的培养基接种于96孔培养板，于37 ℃、体积分数5% CO2充分湿化条件下培养24 h。待细胞贴壁后，按每孔20 μL的量加入样品，每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。继续培养48 h后，每孔加入10 μL 5 g/L的 MTT试剂，继续孵育4 h后，吸弃上清液，每孔再加入150 μL DMSO，轻微震荡反应5～8 min，使结晶颗粒充分溶解。空白对照组调零，用酶标仪以490 nm波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值，用5个浓度梯度做相应细胞株的IC50值，所有实验均重复3次后取平均值。

2 结果与讨论

2.1 提取物EE和紫杉醇的紫外吸收

由提取物EE和紫杉醇的紫外吸收光谱(图1)可知，提取物EE有2个吸收峰，在200～250 nm的最大吸收峰的位置与生物碱类化合物的吸收峰相似，与文献[10]报道相一致，由此推测提取物EE中可能含有生物碱类化合物，而260～300 nm的吸收峰应为紫杉醇的吸收峰。提纯得到的紫杉醇紫外吸收光谱只在272 nm 处有一吸收峰。

2.2 提取物EE和紫杉醇的抗氧化活性

由表1可见，紫杉醇也对自由基表现出良好的清除活性，尽管其清除自由基的活性不如BHT，但紫杉醇清除这4种自由基的IC50值均低于标准值10 g/L[11]，说明其具有良好的抗氧化活性，由此推测紫杉醇发挥其抗癌活性可能与抗氧化机制存在一定的联系。紫杉醇与这4种自由基的作用中，其对ABTS+·的清除作用最优，IC50值为46.14 mg/L。

综上可见，提取物EE和紫杉醇均具有良好的抗氧化活性，且提取物EE的抗氧化活性远优于紫杉醇。这可能是由于提取物EE中含有除了紫杉醇以外的其他抗氧化活性成分，从而导致EE抗氧化活性优于紫杉醇。该分析结果与提取物EE的紫外吸收分析结果相符合。

2.3 提取物EE和紫杉醇的抗肿瘤活性

MTT(3- (4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)比色法是一种检测细胞生长和存活的方法[12]。原理是外源性MTT能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死的细胞不具备这种能力。采用二甲基亚砜(DMSO)能把细胞中的甲瓒溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。目前，该方法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选和细胞毒性试验测定等，具有灵敏度高、便捷、经济等特点。故本文以MTT法测试提取物和紫杉醇的抗肿瘤活性(表2)。

表2 提取物EE和紫杉醇对4种癌细胞的半抑制浓度IC50

注：1.同组每系列数据之间比较差异有显著性意义(P<0.05)。

由表2可见，紫杉醇对人非小肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞Bel-7402和子宫颈癌细胞Hela具有优良的抑制活性，而南方红豆杉乙醇提取物EE对A549、MCF-7、Bel-7402和Hela癌细胞的抑制活性则较差，这可能是由于提取物EE中含有较多抗肿瘤活性较差的其他成分，从而导致其抗肿瘤活性总体降低。该结果也与提取物EE的紫外吸收分析结果一致。

3 结论

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(责任编辑 王龙杰)

Antioxidant and Antitumor Activities of Extracts fromTaxuschinensisvar.mairei

LIU Xi1， ZHANG Ye2

(1. College of Chemistry and Pharmaceutical Sciences， Guangxi Normal University， Guilin Guangxi 541004， China;2. Department of Chemistry and Pharmaceutical Science， Guilin Normal College， Guilin Guangxi 541001， China)

Under ultrasound，Taxuschinensisvar.maireiwere extracted with ethanol at 80 ℃ to offer ethanol extract (EE). EE was further extracted with chloroform and separated by column chromatography to offer taxol. Their antioxidant and antitumor activities were then evaluated. The antioxidant activity screening results showed that EE exhibited better scavenging activity than the common antioxidant BHT in these four assays， with IC50of 13.19±1.50， 2.65±0.35， 25.33±1.75 and 343.00±2.13 mg/L， respectively， while taxol showed the worst， indicating excellent antioxidant activity of EE. The antitumor activity screening results demonstrated that taxol showed better inhibition than EE， with IC50of 3.45±1.37， 6.20±0.88， 1.98±0.49 and 1.15±0.27 mg/L， respectively.

Taxuschinensisvar.mairei; taxol; antioxidant activity; antitumor activity; ultrasound-assisted extract

10.16088/j.issn.1001-6600.2016.04.009

2016-04-28

国家自然科学基金资助项目(21501032)；广西自然科学基金资助项目(2014GXNSFBA118050,2016JJA120113)；广西高等学校优秀中青年骨干教师培养工程资助项目(桂教办[2013]258号)；广西高校中青年教师基础能力提升资助项目(KY2016YB441)；梧州学院重点科研项目(2014B011)；广西植物功能物质研究与利用重点实验室开放基金资助项目(FPRU2013-6)

张业(1981—)，男(壮族)，广西贵港人，桂林师范高等专科学校副教授，博士。E-mail：zhangye81@126.com

R282

A

1001-6600(2016)04-0055-05

注：刘茜现在梧州学院工作。