Rapid HIT 200在法医DNA检验中的应用

孙 帅，张庆霞，薛卢艳，刘金杰，唐 晖，刘 力,*

（1. 山西医科大学法医学院，太原 030001；2. 北京市公安司法鉴定中心，北京 100192）

Rapid HIT 200在法医DNA检验中的应用

孙 帅1，张庆霞2，薛卢艳2，刘金杰2，唐 晖2，刘 力2,*

（1. 山西医科大学法医学院，太原 030001；2. 北京市公安司法鉴定中心，北京 100192）

目的检验Rapid HIT 200系统快速检测DNA的法医学可应用性。方法将血斑、唾液斑、脱落细胞及各种组织以该系统检测，从灵敏度、适应性、重复性和防污染等方面评估其效能。结果该系统检测全血样本（血液）灵敏度为1 µL，模板量30 pg左右；血斑、组织与唾液斑的检出率均在80 %以上，但对脱落细胞仅为16 %；对测试的100个样本中，未发生样本自身或彼此间的转移污染；对血斑、唾液斑、脱落细胞的重复性检验，其基因座一致性检出率达90 %以上。结论该系统具备防污染能力，对常量检材的检测能力优于微量。

Rapid HIT 200系统；STR基因座；灵敏性；适应性；防污染；重复性

通常法医DNA实验室的检验工作流程包含四个步骤：（1）生物样本的DNA提取；（2）聚合酶链式反应（PCR）扩增短串联重复序列（STR）；（3）毛细管电泳分离；（4）选用软件分析结果。一般需7～8 h完成。近十年来，DNA自动化分析技术取得了显著进步，基因座数量的增加进一步提高了个体识别能力，耗时更短的PCR缩短了DNA定量和STR复制的过程[1-7]。正是由于更快速的检测对于案件的侦查和审判更具时效性和价值，因此提高自动化程度，对生物检材进行更快速检测分析，是法医工作者们永恒的追求。

应用微流控芯片技术研发的Rapid HIT 200系统[8]（IntegenX, Pleasanton CA, USA) 集DNA提取、扩增、电泳和分析四大功能于一体，实现了样品检测自动化，降低了人为操作造成污染的风险，检验可在2 h内完成。本文应用该系统，对其灵敏度、各种现场检材的适应性、可重复性、防污染等方面进行测试分析。

1 材料与方法

Rapid HIT 200系统 (瑞捷200)，采用Promega的DNAIQTM进行样品提取，适配两种PCR试剂：Powerplex®16HS (Promega，USA)和GlobalFilerTM(Life Technologies, USA)，用8道毛细管电泳进行片段快速分离，结果分析应用Gene Marker®HID软件 (Soft Genetics, LLC）。8道毛细管中，5道为检测样本，其余3道分别为阴、阳性对照和Ladder。

因样品在样品盒中有可能发生漂移，因此使用Rapid HIT 200系统，最好对检材作固定处理，该系统设有两种检测模式：一种针对于常量检材，选用口腔拭子；另一种针对于微量检材，选择其他工具模式。常量模式的PCR循环次数比微量模式少两个循环，电泳结束后，用Gene Marker HID®V2.6.13软件对电泳数据进行STR分型。

1.1 灵敏性

针对检材的灵敏性，将全血检测分为两类：一类为未稀释的全血，分别取全血5、3、1 µL均匀地涂于棉签头部；另一类取5 µL全血分别按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶150、1∶250的比例稀释，而后分别取20 µL稀释血均匀地涂于棉签头部，上述按照不同比例稀释的血的实际含量分别相当于全血量的3.3, 2.0, 1.0, 0.4, 0.2, 0.13, 0.08 µL。自然阴干30 min后，将两类样本棉签置于检测通道中。

1.2 不同检材适应性

收集不同类型的检材，包括血斑49份、唾液斑26份、组织(包括肌肉、皮肤、肝脏、脾脏、心脏和脑组织)40份、脱落细胞50份。

1.3 防污染性

系统运行时，样本自身或彼此转移过程中可能会发生污染，因此有必要评估其防污染能力。使用空白拭子即未使用过的棉签，用于检测样本自身或在彼此转移过程中发生污染的可能性（测试空白拭子是否能检出STR真峰，有检出即发生了污染）。该系统的每次运行都设置空白拭子作检测对照。

1.4 重复性研究

血斑来源于8名个体 (分别为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8)，分别重复检验次数为2、2、2、4、5、5、6、6；唾液斑来源于5名个体（分别为B1、B2、B3、B4、B5)，分别重复检验次数为2、3、3、3、6；脱落细胞样本源于2名个体 (分别为C1、C2)，均重复检验2次。对检出的基因座数量进行统计。

上述4种研究方法均采用GlobalFilerTM系统进行检验。

2 结果

2.1 灵敏性

即未稀释的全血与稀释后的全血（在不同稀释比例条件下各取20 µL）所分别检出基因座数目的比较。全血最低阈值含量的完整基因座检出图谱如图1，检出情况见表1。

图1 全血最低阈值含量的基因座检出完整图谱Fig.1 The complete genetic profles detected under the lowest threshold of whole blood volume

2.2 不同检材的适应性

血斑、组织、唾液斑、脱落细胞检出的等位基因百分比见表2。

2.3 污染的研究

本测试Rapid HIT 200系统共设置了100个空白拭子样本，均未显示发生样本自身或彼此间的污染。

2.4 重复性

血斑、唾液斑、脱落细胞经不同重复次数的检测，其基因座一致性检出率见表3。

3 讨论

3.1 灵敏性

由表1可见，随着全血量的减少，无论是未稀释全血，还是稀释全血，检出基因座数目都呈递减趋势；同时尽管稀释后全血实际含量≤未稀释全血量，但检出的基因座数目却是对应稀释后全血≥未经稀释全血。这可能是稀释的血液中抑制PCR反应的血红素含量减少所致。此外，未稀释全血较稀释后血因粘度原因从枪头内不能完全排净，而使得实际被测血量亦即DNA量减少，也会使检出基因座数目降低，或又是另一个原因。通过比较未经稀释和稀释后全血所检出的基因座数目，推测Rapid HIT 200系统检测血液样本的灵敏度为1 µL全血，即模板量30 pg左右。

表1 不同全血量的检出情况Table 1 The detected STR loci numbers under various whole blood volumes

表2 不同类型检材检出情况汇总表Table 2 Ratio to total amount of each item by the respective item-different samples exposing their STR loci to certain extent

3.2 不同检材的适应性

当检出的等位基因数百分比在95 %～100 %区间时，血斑、组织、唾液斑样本比例远超半数，分别为91.8 %、80 %、100 %，而脱落细胞样本的比例最低，仅为16 %。这是由于血斑、组织细胞、唾液斑等常量检材的细胞含量大，DNA模板量高，故基因座数目检出多，而微量检材脱落细胞数量相对较少，模板量低，故检出比例也就少。由此可见，Rapid HIT 200系统对常量检材的检测能力优于微量检材。但是，检测样本数的不同会影响检出基因座的比率分布区间占比，比如，组织样本数为12时，其检出等位基因百分比区间50 %～80 %的检材数为3（25 %），80 %～95 %区间是0，95 %～100 %区间为9（75 %）；而对于脱落细胞，当样本数为30时，其在50～80%检出等位基因百分比区间的检材数为20（66.7 %），80 %～95 %区间是2（6.7 %），95 %～100 %则为8（26.7 %）；与表2其各自检材总数为40和50时所呈现的相应比率分布区间明显不同，概因低样本数时检材个体差异所导致的统计分布异常使然。因此，欲得到符合规律和常理的实验结果，样本总数不能太少。不过，这些结果恰也证明Rapid HIT 200系统能够准确反映检测样本的真实情况。

3.3 污染的研究

在空白拭子中发现一些非特异性谱带，即非等位基因基线位置出现一些未标记的等位基因，但是其峰高均低于100 RFU，显著低于从血拭子中获得的特异性峰高。非特异性谱带有拔起峰、钉子峰等，这几类峰可采用Gene Marker HID®V2.6.13软件加以分析删除。对于在黄色和紫色条带的空白拭子中观察到的拔高伪峰，则可能是在没有相匹配的STR-PCR复制子存在的情况下，毛细管电泳产生的信号强度过高所致[9]。因此，可排除所检测的血拭子有外源性污染的问题。以上结果表明当Rapid HIT 200系统由专业法医学实验人员操作时，从样本进样到图谱显示，应不会有污染产生。

表3 不同样本重复性研究基因座检验结果Table 3 Reproducible detectivity of the STR loci from the item-various samples

对于每一个空白拭子的各荧光条带的峰信号强度要实验确定其分析阈值（Analytical threshold，AT），该阈值可用于区别一个真正等位基因峰和基线杂信号。因蓝色通道最小阈值为17RFU、绿色通道10RFU、黄色通道13RFU、红色通道16RFU、紫色通道46RFU，故针对于所有荧光通道可设AT值为50RFU。

本测试结果表明，所有实验样本中空白拭子AT值均在50RFU以下；所有STR分型图谱没有杂峰，峰高比例均衡，故样本运行中未发生样本自身或彼此间转移的污染。Rapid HIT 200系统的运行应是防污染的。

3.4 重复性

血斑、唾液斑和脱落细胞的基因座一致性检出率很高，均在90 %以上，可见Rapid HIT 200系统对常见样本的重复性检测性能好。Rapid HIT 200系统运行方便，具有快速便捷的优点。本测试推测该系统检验血液样本的灵敏度为1 µL全血，即DNA模板量30 pg左右，检测常量检材能力优于微量检材，具有防污染能力，对于血斑、唾液斑和脱落细胞等检材均具有很高的重复性。故Rapid HIT 200系统可用于法医DNA快速检测，但其样本适应性还需进一步改善。

［1］ Greenspoon SA, Ban JD, Sykes K, et al. Application of the BioMekR 2000 laboratory automation workstation and the DNA IQTM system to the extraction of forensic casework samples［J］. J. Forensic Sci., 2004, 49: 29-39.

［2］ Fregeau CJ, lett CM, Elliott J, et al. Automated processing of forensic casework samples using robotic workstations equipped with nondisposable tips: Contamination prevention［J］. J Forensic Sci, 2008, 53: 632-651.

［3］ Hares DR. Expanding the CODIS core loci in the United States［J］. Forensic Sci Int Genet, 2012, 6: e52-e54.

［4］ Foster A, Laurin N. Development of a fast PCR protocol enabling rapid generation of AmpłSTR® Identifiler profiles for genotyping of human DNA［J］. Invest Genet, 2012, 3: 6.

［5］ Dvais CP, King JL, Budowle B, et al. Extraction platform evaluations: a comparison of automate expressTM EZ1® advanced XL, and Maxwell® 16 bench-top DNA extraction system［J］. Legal Med, 2012, 14: 36-39.

［6］ Stangegarrd M, Brsting C, Ferrero-Miliani L, et al. Evaluation of four automate protocols for extraction of DNA from FTA cards［J］. J Lab Autom, 2013, 18: 404-410.

［7］ Flores S, Sun J, King J, et al. Internal validations of the GlobalflerTM Express PCR amplifcation kit for the direct amplifcation of reference DNA samples on a high-throughput automated workfow［J］. Forensic Sci Int Genet, 2014, 10: 33-39.

［8］ Holland M, Wendt F. Evaluation of the Rapid HITTM 200, an automated human identification system for STR analysis of single source samples［J］. Forensic Sci Int Genet, 2015, 14: 76-85.

［9］ Hennessy LK, Mehendale N, Chear K, et al. Developmental validation of the Globalfler® express kit, a 24 marker STR assay on the Rapid HITTM 200 system［J］. Forensic Sci Int Genet, 2014, 13: 247-258.

The Applicability of Rapid HIT 200 Apparatus for Forensic DNA Test

SUN Shuai1, ZHANG Qingxia2, XUE Luyan2, LIU Jinjie2, TANG Hui2, LIU Li2,*
(1. The Forensic College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2. Beijing Identifcation Center for Public Security and Justice, Beijing 100192, China)

ObjectiveTo test the applicability of Rapid HIT 200 apparatus into quick detection of forensic DNA.MethodsRapid HIT 200 apparatus was used to test the samples including whole blood fluid, bloodstains, saliva stains, exfoliated cells and tissues, for evaluating its sensitivity, adaptability, reproducibility and preventability against contamination.ResultsThe sensitivity for testing whole blood fuid is 1µL, equivalent to 30 pg quantity of DNA template. For the quantity-eligible samples of tissues, bloodstains and saliva stains, more than 80 % of the tested genetic loci are shown their genotyping profles, whereas mere 16 % of the tested genetic loci are exposed for the exfoliated cells. Among the 100 samples processed by Rapid HIT 200 apparatus, no contamination occurs within the samples themselves or one another during their transferring or testing. The reproducibility and consistency of the tested genetic loci exceed 90% for either the bloodstains or saliva stains or exfoliated cells.ConclusionsRapid HIT 200 apparatus is capable of preventing contamination, applicable for detecting DNA extracted from both the quantity-normal samples and trifing ones albeit a better result prone to emerge for the former than the latter ones.

Rapid HIT 200 apparatus; STR loci; sensitivity; adaptability; preventability against contamination; reproducibility

DF795.2

B

1008-3650(2016)06-0500-04

2015-09-20

格式：孙帅，张庆霞，薛卢艳，等. Rapid HIT 200在法医DNA检验中的应用[J]. 刑事技术，2016,41(6):500-503.

10.16467/j.1008-3650.2016.06.017

孙帅（1989—），男，山西忻州人，硕士研究生，研究方向为DNA法医学研究与应用。E-mail: ss0030@163.com

* 通讯作者：刘力（1963—），男，辽宁沈阳人，主任法医师，硕士，研究方向为法医学。E-mail:13901212325@163.com