RLRs治疗多发性硬化症的研究进展

刘路，杜芳腾，文艺，张吉翔



RLRs治疗多发性硬化症的研究进展

刘路，杜芳腾，文艺，张吉翔△

摘要：目前，多发性硬化症（MS）的病因及其发病机制尚未清楚。RIG-Ⅰ样受体(RLRs)是新发现的一类模式识别受体(PRRs)，位于细胞质内，可识别病毒双链RNA的解旋酶，并通过自身的半胱天冬酶活化募集结构域（CARD）与干扰素β启动刺激因子（IPS）-1发生相互作用，形成IPS-1信号小体，诱导干扰素Ⅰ型（Ⅰ-IFN）的表达，从而启动免疫应答以及诱导抗病毒反应。研究发现，缺乏IPS-1的小鼠疾病将继续恶化，伴随高炎症反应，从而加重轴突损伤和脱髓鞘病变。此外，若启动免疫细胞上的RLRs，能缓解MS小鼠的炎症并预防髓鞘的断裂，从而降低麻痹的发生率。本文就RLRs治疗MS的研究进展进行综述。

关键词：多发性硬化；干扰素Ⅰ型；综述；RIG-Ⅰ样受体；干扰素β启动刺激因子

多发性硬化症（multiple sclerosis,mS）是中枢神经系统(central nervous system, CNS)的炎性脱髓鞘性自身免疫性疾病，当MS的免疫细胞进入CNS的髓鞘并攻击髓鞘和神经元时，可导致脱髓鞘和轴突损伤，临床上表现为视神经炎、疲劳、麻木、肌无力、认知损伤等症状[1]。MS的病因及其发病机制至今尚不清楚，临床普遍认为其与遗传、免疫、环境因素如病毒感染等有关。有研究表明，RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰlike receptors，RLRs)作为Th1和Th17细胞在CNS中应答的负性调节剂，在大脑炎症中起保护性作用，并建立了RLRs寡核苷酸类配体治疗MS的方法[2]。现就RLRs治疗MS的研究进展综述如下。

1　RLRs成员的结构及其信号通路

RLRs是抗病毒信号通路的胞内受体蛋白，主要包括视黄酸诱导基因（RIG）-Ⅰ、黑色素瘤分化相关基因MDA5和LGP2[3]。所有的成员都包括位于中心的DEX/DH解旋酶结构域、N末端结构域和C末端结构域（CTD）。在RLRs家族中，RIG-Ⅰ和MDA5均有2个特征性的CARD结构域位于N-末端，该结构域可与其他包含CARD的蛋白相互作用。解旋酶结构域保留着催化结合和水解双链RNA（dsRNA）的三磷酸腺苷（ATP）酶解作用。CTD在与dsRNA结合时起着高亲和力的作用，可编码RIG-I中的阻遏域(repressor do⁃main，RD)。

当病毒RNA被RLRs信号识别时，RIG-Ⅰ和MDA5通过它们的CARDs和干扰素（IFN）-β启动刺激因子(IPS) -1 的CARDs相互作用，从而启动抗病毒信号，导致细胞核因子(NF) -κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein ki⁃nase，MAPK)激活，以及干扰素调节因子(IFN regulatory fac⁃tors，IRFs)对干扰素Ⅰ型（typeⅠinterferon，Ⅰ-IFN）、炎症细胞因子的诱导作用开启；IPS-1的跨膜结构域锚定到线粒体和过氧化物酶体上，IPS-1被证实有双相抗病毒反应作用[4]。在过氧化物酶体膜上，IPS-1激活IRF1以及IRF3，导致选定的抗病毒基因迅速表达，并且立即触发了Ⅰ-IFN抗病毒反应。在感染后期，位于线粒体膜的IPS-1可诱导IRF3/7激活，进而触发Ⅰ-IFN表达，随后通过上调Ⅰ-IFN受体信号的干扰素刺激因子（interferon-stimulated genes，ISGs）、Ⅰ-IFN诱导感染细胞以及非感染细胞的抗病毒状态，启动适应性免疫应答[5]。

现有研究表明，RLRs信号通路主要通过宿主蛋白诱导的翻译后修饰（posttranslationalmodifications，PTMs）以及转录后构象变化进行调控[6]。泛素化以及磷酸化是其主要的PTMs[5]。RLRs信号其实是病毒RNA结合、发生构象变化和一系列翻译后修饰的一个多步骤过程。现已确定有多个转录后构象变化调节RLRs信号，包括miRNAs的降解以及小非编码RNAs的降解，或者是靶因子mRNAs的翻译抑制。正常情况下，PTMs可抑制RLR信号的一部分负反馈环路，防止抗病毒和促炎性因子诱导的蛋白过度生成。最近关于PTMs的研究发现，RIG-Ⅰ和MDA5信号状态与RLRs信号在病毒感染和自身免疫性疾病的刺激下的激活有关[5]。

RLRs信号的激活可导致宿主细胞与病毒RNA结合，E3泛素连接酶介导K63连接RIG-Ⅰ的抑制结构域泛素化，从而使它们能与E3泛素连接酶、三基序蛋白25（tripartitemo⁃tif 25，TRIM25）和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)相互作用，RIG-Ⅰ的N末端的CARDs通过TRIM25与赖氨酸-63连接泛素化，诱导RIG-Ⅰ寡聚化，与IPS-1相互作用，从而启动下游信号并最终导致Ⅰ-IFN以及其他先天应答基因的转录。有研究证实，TRIM25合成K63-多聚泛素蛋白，该蛋白可直接结合到RIG-Ⅰ的CARD，介导下游信号结合到IPS-1，无需结合RIG-Ⅰ的泛素蛋白[7]。

2　RLRs的功能

PRRs除了参与免疫应答，还能够调节细胞增殖、存活、凋亡及自噬，参与调节活性氧生成、细胞凋亡、血管生成，并因此产生组织重塑和修复。另外，RLRs还可识别细胞中的其他RNA以及激活抗病毒反应，包括Ⅰ-IFN的诱导、炎性激活、促炎细胞因子和趋化因子的表达。

在大多数组织中，RNA病毒在胞浆中被RLRs信号识别，随后启动级联信号诱导Ⅰ-IFN的表达，从而产生抗病毒反应[8-9]。Yan等[10]研究显示，小鼠卵巢颗粒细胞表达TLR3、RIG-Ⅰ、MDA5，它们共同介导卵巢细胞中的先天抗病毒反应，有助于防御卵巢病毒感染。有研究表明RLRs激动剂尤其是在限制病毒感染时可能产生显著治疗潜力[11]。在HCV感染的小鼠体外模型中，免疫细胞通过HCV RNA的病原体相关分子模式(pathogen-associatedmolecular patterns，PAMP）触发RIG-Ⅰ信号激活，该过程能抑制HCV感染[12]。van Kasteren等[13]研究显示动脉炎病毒（arterivirus）和内罗病毒（nairovirus）DUBs（deubiquitinating enzymes）的过度表达可抑制RIG-Ⅰ泛素化，认为RIG-Ⅰ有可能参与了应对动脉炎的感染过程。

病原微生物进入宿主体内后，宿主RLRs先识别病原微生物的特定组分PAMPs并且与其相互作用，随后PRRs启动特定的细胞内信号途径的免疫应答，诱导各种自身防御基因的表达，进而参与炎症反应及免疫反应[3]。近年来研究表明，RLRs信号通路在细菌感染中同样发挥着重要的功能；与野生型小鼠相比，缺乏IPS-1的小鼠对感染不敏感并且显示出较低的IFN-β表达，较高的Th1型细胞因子如IFN-γ和白细胞介素（IL）-12的产生和较低的Th2型细胞因子IL-4、IL-13的产生[12]。病原体致病菌的感染比鼠疫杆菌更易改变RLRs信号通路的表达，这表明RLRs信号通路是细菌感染中一条较为普遍的通路[14]。

3　RLRs与MS

最近研究表明，RLRs信号缺失的小鼠可加重CNS自身免疫性疾病[15]。目前已经证实，在MS患者的外周血细胞中RLRs信号活性增强；RLRs信号通路的遗传改变可导致免疫应答缺陷，并且增加自身免疫性疾病的易感性[15]。研究发现，若启动免疫细胞上的RLRs，能缓解MS小鼠炎症并且预防髓鞘的断裂，从而降低麻痹的发生率[2]。这可能涉及了疾病的多种保护机制，例如抗原的加工与递呈、T细胞的抑制、细胞因子的调节、基质金属蛋白酶及黏附分子的下调；以上这些均能够抑制淋巴细胞迁移至血脑屏障。

3.1IPS-1与自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)mS是由Th1和Th17细胞诱导，是可直接抵抗CNS髓鞘少突胶质细胞的一种疾病。本病的组织学特点是：致脑炎性的Th1/Th17-诱导极化的CD4+T细胞、B细胞和大量髓样细胞浸润，从而导致严重的脱髓鞘，最终导致神经结构变性[16]。MS患者的标本中IL-1B、IL-18以及半胱天冬酶均有过度表达[17]。研究发现，缺乏IPS-1的实验性EAE模型小鼠中的MS发病率达100%[2]。在缺乏IPS-1的脊髓中，脊髓普遍存在有过多巨噬细胞浸润。一般情况下，增加IPS-1-/-小鼠脊髓中巨噬细胞的内向通入可导致兴奋性T细胞数量增多，产生比IPS-1+/+小鼠更强的脱髓鞘改变；因此，在缺乏IPS-1所致严重的EAE中，MS的发生可能与Th1、Th17的转移免疫应答有关，而同时Th2的反应仍可保持正常；此外，IL-17的主要产生者能通过IL-1β及IL-23通路放大Th17反应与自身免疫[4]。Suthar等[18]研究显示，IPS-1-/-小鼠在先天免疫以及适应性免疫方面表现出严重的失调，并且易患神经感染，表现出对西尼罗病毒具有易感性。

3.2RLRs的活化Luber等[19]研究发现，RLRs差异性表达于特定的树突细胞亚群，在CD4+和CD4−/CD8−树突细胞中，RLRs可以在各种树突细胞亚群起到抗原呈递和产生细胞因子的作用。聚肌胞甘酸（polyinosinic-polycytidylic acid injec⁃tion，Poly IC）有辅助性增强体液和细胞免疫的作用，同样自然杀伤细胞依赖的抗肿瘤性Poly IC是由TLR3、RIG-Ⅰ和MDA5识别。有研究显示，在缺乏TLR3和RLRs信号通路的小鼠中，起增强Poly IC作用的抗原特异性抗体、抗原特异性CD8+T细胞和IFN-γ可完全缺失[20]，这表明TLRs和RLRs的组合性识别对于增强先天性和适应性免疫应答均必不可少。

目前研究发现，RLRs配体5′-三磷酸RNA寡核苷酸活化时，将会减少CNS的炎症反应，可改善疾病的临床症状；利用RIG-Ⅰ配体(3pRNA)或者Poly IC激活RIG-Ⅰ和MDA5时，所有的实验组在疾病起始期和高峰期均有100%的发病率，并且在疾病高峰期时重复注射RIG-Ⅰ配体，可以明显缓解临床症状；同时疾病严重程度在RIG-Ⅰ和MDA5刺激的小鼠实验效应阶段是明显减弱的[2]。

此外，de Rivero Vaccari等[21]研究表明，RIG-Ⅰ和MDA5的表达水平在脊髓损伤后6h显著增加，而线粒体相关蛋白IPS-1在任何时间均没有改变；增加的IFN-α和IFN-β同样在脊髓损伤后6h检测到，该研究认为脊髓损伤以及星形胶质细胞的牵拉损伤可刺激RLRs信号，然后通过IRF3磷酸化导致Ⅰ-IFN的产生[21]。另有研究显示，在慢性病阶段，脊髓中可见许多巨噬细胞和淋巴细胞浸润，而在RIG-Ⅰ和MDA5刺激的小鼠中它们的数量急剧减少，并且淋巴细胞和巨噬细胞数量在RLRs活化时亦减少[22]。

3.3RLRs通过IFN受体信号通路改善疾病细胞缺乏RLRs信号通路中的任何一部分将使其抗病毒反应缺失，反而增强病毒复制，表明RIG-Ⅰ和MDA5通过诱导先天免疫反应以及IFN信号扩增来控制病毒感染[11]。因此，RLRs和Ⅰ-IFN信号在CNS损伤诱发的炎症反应中起着重要的作用。许多研究表明，RLRs改善疾病需要通过干扰素Ⅰ型受体（ⅠIFN receptor，IFNAR）通路传递[2,21]。研究发现，即使是使用RIG-Ⅰ及MDA5配体处理的IFNAR-/-小鼠，其EAE的临床症状亦未见明显改善；这说明RLRs信号通路改善疾病需要IFNAR的传递，并且IFN-β、IRF7、类泛素蛋白（ISG）15、UBP43、IL-27p28等在RLRs信号通路下被强烈诱导，同时MDA5的活化可能上调了Th17细胞相关因子如IL-1、IL-6、IL-23p19、转化生长因子（TGF）-β、RORγT的表达[2]。

Kzlinke等[23]研究显示，与IFNAR-/-的小鼠相似，RLRs信号缺失的小鼠CNS自身免疫性疾病的发生率显著增加且病情加重，而野生型小鼠骨髓细胞触发Ⅰ-IFN后，脑损伤减少。这表明RLR配体的治疗效果可能与CNS内Th1、Th17 的T细胞反应的负性调节有关，触发RLRs信号刺激内源性Ⅰ-IFN免疫调节有可能作为一种新的策略来治疗MS。

RNA配体介导的疾病症状的改善是由可溶性因子如Ⅰ-IFN或者来自树突状细胞刺激产生的IL-27介导，这些因素最终抑制脑炎Th1和Th17的免疫反应[24]。和Th1细胞相比，Th17细胞更易受IFN-β的影响，这可能是由于IFNAR信号通路在Th17细胞中高表达所致[25]。因此，CNS自身免疫性疾病可通过RIG-I和MDA5抑制Th1和Th17细胞免疫，从而诱发Ⅰ-IFN应答——抑制T细胞膨胀和诱导T细胞凋亡[2]。

4　展望

综上所述，通过PRRs诱导先天免疫反应是宿主防御致病因子的关键。然而，PRRs应答的异常激活与各种各样的疾病紧紧相关，包括炎症、自身免疫性疾病及肿瘤等。因此，PRRs反应的负性调节对于维持内环境稳定至关重要。RLRs信号激活可诱导Ⅰ-IFN产生，从而抑制CNS中的自身免疫性炎症和脱髓鞘，改善MS的临床症状。目前RIG-Ⅰ的配体3pRNA为独立的RNA序列，可影响Th1、Th17免疫反应调控。未来的研究可以将重点放在3pRNA的开发，它可以沉默Th1及Th17相关基因和激活RLRs信号。这种方法可能产生一种新的具有双重功能的RNA分子，从而在治疗自身免疫性疾病方面发挥重要作用。

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（2015-04-29收稿2015-07-17修回）

（本文编辑陆荣展）

Research progress on RLRs in the treatment ofmultiple sclerosis

LIU Lu, DU Fangteng, WEN Yi, ZHANG Jixiang△
Department of Gastroenterology，Second Afiliatedhospital，Nanchang University，Nanchang 330006，China
△Corresponding Author E-mail: jixiangz@tom.com

Abstract:At present, the etiology and pathogenesis ofmultiple sclerosis are unclear.RIG-Ⅰ-like receptors are a new⁃ly discovered pattern recognition receptors (RLRs), which are located in cytoplasm.They can recognize thehelicase of viral dsRNAs, and interact with interferon beta promoter stimulator (IPS)-1 through their caspase activation recruitment domain (CARD), then form IPS-1 signalsome and induce the expression of interferon typeⅠ(Ⅰ-IFN), thereby initiate innate im⁃mune response and induce antiviral response.Recent studieshave found thatmice lacking IPS-1 would develop exacerbated disease and accompanied bymarkedlyhigher inflammation, increasing axonal damage and demyelination.Furthermore, initi⁃ating the RIG-Ⅰ-likehelicase receptor on the immune cells can alleviate inflammation andmyelin fracture inmultiple scle⁃rosis ofmousemodel, thus limit the incidence of paralysis.This paper is a review about the research progress on RLRs in the treatment ofmultiple sclerosis.

Key words:multiple sclerosis；interferon typeⅠ；review；RIG-Ⅰ-like receptor；IPS

作者简介：刘路（1990），女，硕士在读，主要从事上消化道出血危险因素的研究△通讯作者E-mail：jixiangz@tom.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81360074）

中图分类号：R744.51

文献标志码：A

DOI:10.11958/58834

作者单位：南昌大学第二附属医院消化内科（邮编330006）