含pPpa的水通道蛋白AQPZ在无细胞体系中的表达及其水过滤特性

庄冰佳, 于道永, 黄 磊, 徐志南, 蔡 谨

(1. 浙江大学 化学工程与生物工程学院, 浙江 杭州 310027；

2.中国石油大学(华东) 化学工程学院, 山东 青岛 266580)

含pPpa的水通道蛋白AQPZ在无细胞体系中的表达及其水过滤特性

庄冰佳1, 于道永2, 黄 磊1, 徐志南1, 蔡 谨1

(1. 浙江大学 化学工程与生物工程学院, 浙江 杭州 310027；

2.中国石油大学(华东) 化学工程学院, 山东 青岛 266580)

水通道蛋白Z(AQPZ)具有水选择专一性强、渗透性高等特点，可广泛用于制备水回收和脱盐的生物仿生膜。定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)，使其可催化非天然氨基酸(丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine,pPpa))合成对应氨酰tRNA。将上述转运系统与大肠杆菌无细胞体系结合，在AQPZ的特定位点引入了pPpa将改性的AQPZ（P-AQPZ）重构到1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC)，经停留光谱分析，其水渗透因子Pf值为3.42×10-4m·s-1，是AQPZ的2.78倍。用截留反渗透装置分析发现P-AQPZ仿生膜的水通量高于AQPZ仿生膜并可保持较高的截盐率。

非天然氨基酸；水通道蛋白Z；基因编码；生物仿生膜；无细胞体系

1 前 言

利用基因编码非天然氨基酸技术[1]已可将90多种非天然氨基酸成功用于编码蛋白质[2]。Schultz[2]发现古细菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)与对应的tRNA(MjTyrRS/MjtRNATyr)能够识别终止密码子TAG而产生转运酪氨酸的作用。因此如果目的基因中含有TAG密码子，利用该转运系统就可以避免翻译终止并在此位点定点插入酪氨酸。进一步研究[3]发现，突变MjTyrRS/MjtRNATyr可以转运某些非天然氨基酸到目的基因的TAG密码子上，从而增强蛋白性能，稳定蛋白结构，甚至产生新的功能。

水通道蛋白Z(AQPZ)[4]在水分子进出大肠杆菌细胞膜的过程中起关键作用。AQPZ对蛋白酶和汞离子具有抗性，且不易被其他生物大分子抑制[5]，因此在仿生废水回收以及海水淡化领域具有重要的应用价值[6,7]。传统生物仿生膜以流动镶嵌模式将AQPZ嵌入两亲性双嵌段聚合物或天然磷脂双分子层中[8]，但这种以疏水作用嵌入的水通道蛋白较易流失，从而影响整个膜的使用性能与寿命。

近年来针对含功能膜通道蛋白的仿生膜，研究者开展了一系列工作来增强膜的性能。本文首次从改性水通道蛋白这一角度出发，拟在AQPZ蛋白中基因编入非天然氨基酸而改变其肽链结构，使其氨基酸残基中含有炔基，为制备多样的稳定型生物仿生膜提供新的可能。研究通过定点突变来源于詹氏甲烷球菌中的TyrRS，使其可催化非天然氨基酸(丙炔氧基-L-苯丙氨酸 (p-propargyloxyphenylalanine, pPpa))合成对应的氨酰tRNA。继而，在无细胞表达体系中，将pPpa引入AQPZ，表达形成P-AQPZ。将P-AQPZ和1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)组装成脂蛋白体，利用停留光谱分析其透水功能，测定水通道蛋白的活性。采用静电吸附法制备水通道蛋白嵌入的生物仿生膜，通过截流反渗透装置测定仿生膜的分离性能。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验菌株与质粒

实验菌株：大肠杆菌Escherichia coli DH5α，Escherichia coli BL21(DE3)(Novangen,USA)；

质粒：pIVEX2.4c、pIVEX2.4c-AqpZ、pETDuet-CK-T7、pUC-MjtRNA；

菌株和质粒均为本实验室保藏。

2.1.2 试剂

DOPC购于Avanti公司；丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine, pPpa)[9]由Amatek Chemical公司合成；限制性内切酶、LA Taq DNA 聚合酶和T4 DNA 连接酶均购自Takara。PCR 扩增所用的引物及基因片段由上海生工合成；Western-blot相关试剂购自碧云天生物技术研究所；聚乙烯亚胺和聚苯乙烯磺酸钠均购自Sigma公司；SM-2生物珠购自Bio-rad公司。

2.2 方法

2.2.1 载体构建

1.TyrRS的突变

以p15a-MjtyrRS为模板，利用RS F2/ RS R4和RS F4/ RS R2两对引物通过PCR扩增获得两个DNA片段，将这两个DNA片段同源重组得到含三个位点突变(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala)的氨酰tRNA合成酶质粒。以上述突变质粒为模板，利用RS F1/ RS R3和RS F3/ RS R1两对引物，进行第二轮突变获得包含5个位点(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala/Phe110Ala/Asp158Ala)突变的TyrRS，突变后的氨酰tRNA合成酶命名为MjpPpaRS，获得p15a-MjpPpaRS质粒。以质粒p15a-MjpPpaRS 为模板进行PCR即可得到MjpPpaRS基因，将PCR扩增的MjpPpaRS基因片段用NcoI/BamHI酶切处理连接到pIVEX2.4c上得到重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS。

2.AQPZ的定点突变

对AQPZ的F10、F13、F17三个位点进行琥珀突变，以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，用引物aqpz32-36-F/aqpz32-36-R和aqpz48-F/aqpz48-R进行两轮全质粒PCR后获得pIVEX2.4c-AqpZ TAG，所用引物见表1。

2.2.2 大肠杆菌S30-MjpPpaRS/MjtRNA和S30-pETDuet-CK-T7抽提物制备

将pUC-MjtRNA与p15a-MjpPpaRS两种质粒导入同一个E. coliBL21(DE3)细胞中用于大肠杆菌无细胞表达体系抽提物的制备。用含有T7 RNA聚合酶(T7)与磷酸丙酮酸激酶(CK)两个基因的pETDuet-CK-T7质粒转化E. coliBL21(DE3)细胞，利用其制成大肠杆菌抽提物。大肠杆菌抽提物制备主要参照Kim DM等[10]的方法，将发酵得到的大肠杆菌菌体进行高压破碎后离心获得上清液，上清液于37℃孵育2 h后在超低温(-80℃)冰箱冷冻储藏，分批取用。

2.2.3 大肠杆菌无细胞表达蛋白及其纯化

大肠杆菌无细胞表达体系的配置如表2所示。

在224 μL无细胞反应体系[11]中加入终浓度为1.0%的Brij-78用于P-AQPZ可溶性表达。224 μL大肠杆菌无细胞表达体系在37℃恒温金属浴中以400 r·min-1振荡反应4 h后，12000 g离心10 min，分离反应液中的上清液和沉淀。用平衡缓冲液(20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.8，300 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1imidazole，0.05% Brij-78)将上述无细胞反应上清蛋白液稀释5倍(即将800 μL平衡缓冲液与200 μL蛋白液混合)，加入1 mL Ni2+-NTA树脂，4℃、120 r·min-1震荡1 h。用5 mL的平衡缓冲液冲洗未与Ni2+-NTA树脂结合的可溶性杂蛋白。再用1 mL的洗脱缓冲液(MOPS-KOH、pH 7.5，300 mmol·L-1imidazole，0.05% Brij-78)洗脱得到目标蛋白。

表1 突变所用引物Table 1 Primers designed for mutation

表2 大肠杆菌无细胞表达体系组分表Table 2 Composition ofE. colicell-free system

2.2.4 AQPZ和P-AQPZ脂蛋白体的制备

AQPZ和P-AQPZ蛋白溶液终浓度为100 μg·mL-1，DOPC脂质体溶液[8]终浓度为4 mg·mL-1，Triton X-100终浓度为0.25%(m/v)。25℃、120 r·min-1下震荡30 min后以0.2 g·mL-1加入SM-2生物珠继续震荡2 h。吸取上清液超速离心(300,000 g、15 min、4℃)，沉淀用MOPS-KOH缓冲液(100 mmol·L-1、pH 7.5)洗涤一遍后，再次用MOPS-KOH缓冲液(100 mmol·L-1、pH 7.5)重悬得到AQPZ和P-AQPZ脂蛋白体。

2.2.5 AQPZ和P-AQPZ脂蛋白体的透水功能分析

采用停留光谱[12](SFM-300，BioLogic)测量脂蛋白体的透水功能。将等体积的AQPZ脂蛋白体溶液和高渗溶液(100 mmol·L-1MOPS-KOH、pH 7.5，400 mmol·L-1NaCl)混合，测定条件参数：Ex = 436 nm，(25.0±0.1)℃。数据符合指数增长方程Y=Ae-kx+y0[13]。

2.2.6 AQPZ和P-AQPZ生物仿生膜的制备和分离性能表征

本文采用静电吸附的方法[14]制备水通道蛋白嵌入的生物仿生膜。通过截流反渗透装置测定仿生膜的分离性能。测试有效膜面积为19.56 cm2，测试压强为4 bar，原料液为 500 ppm NaCl，平行测定三组数据后取平均值。水通量计算公式、膜的截留率计算公式参考王钦沪等人[13]的工作。

3 结果与讨论

3.1 水通道蛋白突变位点和非天然氨基酸的选择

水通道蛋白中插入非天然氨基酸会影响其透水性能及空间结构，同时非天然氨基酸的插入位点也会影响其与磷脂接触发生交联反应的效率。因此，氨基酸突变位点选择的原则为：1、避开其活性中心；2、在水通道蛋白的外侧可与磷脂双分子层接触。通过对AQPZ蛋白的结构分析，F10、F13和F17三个氨基酸不在其活性中心且位于蛋白的外侧，因此选择在上述三个位点引入非天然氨基酸以改进AQPZ性能。pPpa为疏水性非天然氨基酸，因此替换AQPZ中的F10、F13和F17三个苯丙氨酸对水通道蛋白的空间结构及功能影响相对较小。而且pPpa残基中含乙炔基团，可与多种基团形成共价键而增强整个生物仿生膜的强度。因此本研究选用pPpa作为插入的目标非天然氨基酸。

3.2 M jpPpaRS和MjtRNA的功能验证

定点突变氨酰tRNA合成酶MjpPpaRS和MjtRNA使其具有编码pPpa的活性。将pPpa添加到大肠杆菌无细胞表达体系中，考察含琥珀突变AQPZ的表达情况。对比图2中2、3、4、5泳道可以看出，当体系中不添加pPpa时AQPZ蛋白的可溶部分和不可溶部分均检测不到蛋白表达，当添加2 μL pPpa时，在不可溶部分可见有AQPZ表达。证明本研究所构建的MjpPpaRS/MjtRNA可以识别终止密码子，并成功将pPpa编码入蛋白质。为进一步提高目标蛋白的表达量，将pIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒添加入无细胞表达体系中，提高MjpPpaRS在无细胞表达体系中的含量以提高P-AQPZ的表达量。对比图2中4、8两泳道可以看出，在50 μL无细胞体系中加入5 μL pIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒，P-AQPZ表达量最高，达到48 mg·L-1(Quantity One(Bio-Rad)分析得到)，是不添加pIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒时的4倍。

图1 非天然氨基酸结构示意图Fig.1 Structure ofp-propargyloxyphenylalanine

3.3 AQPZ和P-AQPZ表达纯化及功能检测

前期工作中发现在表达体系中添加Brij-78可提高P-AQPZ的可溶性[13]。如图3所示，当表达体系中不添加Brij-78时，P-AQPZ基本以沉淀形式表达(Control)，而当加入终浓度为1.0% Brij-78后，可溶P-AQPZ蛋白比例为56%，产量达最高值。 用Ni2+-NTA树脂纯化，得到浓度为280 mg·L-1的可溶性P-AQPZ。

图2 无细胞体系表达P-AQPZFig.2 Expression of P-AQPZ under different conditions Lane 1, markers； Lane 2, Pellet without pPpa； Lane 3, Supernatant without pPpa； Lane 4, Pellet with pPpa； Lane 5, Supernatant with pPpa； Lane 6, Pellet without plasmid addition； Lane 7, Supernatant without plasmid addition； Lane 8, Pellet with pPpa and pIVEX2.4c-MjpPpaRS； Lane 9, Supernatant with pPpa and pIVEX2.4c-MjpPpaRS

图3 大肠杆菌无细胞体系表达P-AQPZFig.3 Western-blot analysis of P-AQPZ in cell-free system with and without 1.0% Brij-78. S, Supernatant； P, Pellet.

制备AQPZ和P-AQPZ脂质体后采用停留光谱测定其透水功能。DOPC脂质体、AQPZ和P-AQPZ脂蛋白体的水通透因子Pf值见图4。P-AQPZ脂蛋白体的Pf值为3.42×10-4m·s-1；AQPZ脂蛋白体的Pf值为1.23×10-4m·s-1；未崁蛋白的脂质体的Pf值为5.01×10-5m·s-1。AQPZ和P-AQPZ脂蛋白体的透水速率明显比未崁入蛋白的脂质体大，而且P-AQPZ脂蛋白体比AQPZ脂蛋白体的透水速率更高，Pf值大2.78倍。表明所制备的P-AQPZ具有明显的滤水活性，且相较于AQPZ活性提高显著。推测非天然氨基酸的编入可能使水通道蛋白与磷脂的亲和性增强，使水通道蛋白在嵌入磷脂双分子层后更稳定存在。

3.4 A QPZ和P-AQPZ仿生膜分离性能

为了进一步地验证P-AQPZ的透水功能，并探索其在滤水生物仿生膜中的应用，研究制备了嵌入P-AQPZ和AQPZ的磷脂纳滤膜，分析并对比其分离性能。根据文献[12]报道，本文采用水通道蛋白与磷脂(DOPC)的质量比例(PLR)为1/50。水通量是表征膜分离能力的一个重要指标。水通量结果见图5，基膜的水通量为20.8 L·(m2·h)-1，未嵌入水通道蛋白时(即图5中的DOPC柱显示)水通量为6.3 L·(m2·h)-1，嵌入AQPZ时的水通量为18.7 L·(m2·h)-1，嵌入P-AQPZ时的水通量为19.9 L·(m2·h)-1。可见，水通道蛋白的嵌入使仿生膜的水通量显著提升，接近于基膜的通量，其中P-AQPZ比AQPZ的通水性能更优异。截盐率是评价膜分离性能的另一个重要指标，加入水通道蛋白后的仿生膜的截盐率仍能得到保持并有提高(图5)。仿生膜在水通道蛋白未嵌入时截盐率为43.8%，当嵌入AQPZ时截盐率为60.7%，嵌入P-AQPZ时截盐率为68.3%。这说明水通道蛋白确实对仿生膜水通量的提高有明显帮助，且非天然氨基酸的引入没有影响AQPZ的透水功能。

图4 停留光谱测定AQPZ和P-AQPZ的透水效率Fig.4 Stopped-flow light scattering results of AQPZ and P-AQPZ proteoliposomes

图5 AQPZ和P-AQPZ仿生膜的水通量和截盐率Fig.5 Water flux and NaCl rejection of AQPZ and P-AQPZ based biomimetic membranes

4 结 论

本研究通过突变詹氏甲烷球菌的TyrRS，获得了可转运非天然氨基酸pPpa的氨酰tRNA合成酶（MjpPpaRS），并成功将其应用于大肠杆菌无细胞体系中表达含非天然氨基酸的P-AQPZ。通过向大肠杆菌无细胞体系添加pIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒增加了P-AQPZ的表达量。含pPpa的水通道蛋白P-AQPZ最高表达量为48 mg·L-1，纯化浓缩后的最高浓度分别达到280 mg·L-1。经停留光谱检测，P-AQPZ的透水能力较AQPZ提高显著。本工作为制备稳定型高性能滤水生物仿生膜提供了新的思路。

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Expression of p-Propargyloxyphenylalanine-Containing Aquaporin Z in Cell-Free System and its Application in Water Filtration

ZHUANG Bing-jia1, YU Dao-yong2, HUANG Lei1, XU Zhi-nan1, CAI Jin1
(1. College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China；
2. College of Chemical Engineering, China University of Petroleum(East China), Qingdao 266580, China)

Aquaporin Z (AQPZ) is a typical orthodox aquaporin with high water permeability and selectivity, and it could be widely used in biomimetic membrane for water recycling and desalination. Site-specific mutagenesis of tyrosyl-tRNAsynthetase (TyrRS) from Methanococcus jannaschii was processed to synthesize corresponding amino acyl tRNA from unnatural amino acids (p-propargyloxyphenylalanine,pPpa). pPpa was then site-specifically incorporated into AQPZ by combining the above transfer system with a Escherichia coli cell-free system, and the modified AQPZ was reconstituted into 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) liposomes and analyzed by stopped-flow spectroscopy. The results show that the osmotic water permeability value (Pf) of the modified AQPZ proteoliposomes is 3.42×10-4m·s-1, which is 2.78 times higher than that of the AQPZ proteoliposomes. The layer-by-layer membrane embedded with the modified AQPZ demonstrates higher water flux than the AQPZ embedded membrane with same high salt rejection rates.

unnatural amino acids； aquaporin Z； genetic incorporation； biomimetic membrane；cell-free system

Q786

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.00.039

1003-9015(2016)06-1335-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1141.TQ.20161220.1103.002.html

2016-04-12；

：2016-05-30。网络出版时间：2016-12-20 11:03:31

国家自然科学基金资助项目(21276226，21306164)。

庄冰佳(1991-)，女，浙江杭州人，浙江大学硕士生。

：蔡谨，E-mail：caij@zju.edu.cn