基质金属蛋白酶-9基因-1562C/T多态性与过敏性紫癜并发症的关系

方全中 郭爱红 丁振尧 杨娇娇

·经验交流·

基质金属蛋白酶-9基因-1562C/T多态性与过敏性紫癜并发症的关系

方全中 郭爱红 丁振尧 杨娇娇

过敏性紫癜；基质金属蛋白酶-9；基因多态性；并发症

过敏性紫癜（henoch-schoenlein purpura，HSP）是一种临床表现为特征性皮疹、关节疼痛、腹痛、便血、血尿、蛋白尿等症状的小血管炎综合征，其发病机制与免疫和遗传有关。HSP急性期血中炎症细胞因子能上调基质金属蛋白酶（MMP）表达[1-2]。研究[3-4]发现，HSP患儿急性期血清MMP-9水平及循环白细胞中MMP-9的表达水平显著升高，并且MMP-9基因C-1562C/T基因位点存在多态性。本文研究MMP-9-1562C/T多态性与HSP患儿的肾脏损害及胃肠道损害的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月—2015年6月本院确诊的过敏性紫癜（HSP）患儿124例，均符合“过敏性紫癜”的诊断标准[5]。男69例，女55例，年龄4～12岁，平均（7.59±2.36）岁。肾脏损害43例出现血尿和/或蛋白尿症状，无肾脏损害81例。胃肠道损害46例，腹痛、便血或大便隐血试验阳性，无胃肠道损害78例。

1.2 方 法 采用PCR-RFLP方法测定MMP-9基因多态性：（1）提取DNA：抽静脉血2mL，加EDTA抗凝。使用白细胞分离液，离心法分离并收集外周血白细胞，用DNA提取试剂盒从白细胞中抽提基因组DNA，双蒸水溶解，核酸分析仪测定DNA水平后，-80℃冰箱保存。提取全血DNA作为PCR模板，具体操作严格按试剂盒说明书进行。将提取的基因组DNA均置于-80℃冰箱冻存备用。（2）PCR扩增：MMP-9基因-1562C/T各位点引物由上海涵生物科技公司合成，上游引物为5’-GCCTGGCACATAGTA GGCCC-3’，下游引物为5’-CTTCCTAGCCAGCCGG CATC-3’。PCR反应体系为：10×Buffer 2.5μL→ dNTP0.5μL→上下游引物各 1μL→DNA模板0.1μg→2×Taq PCR MasterMix 12.5μL→加双蒸水，总体积为25μL。反应条件为按说明书操作。（3）酶切反应：对PCR产物采用限制性内切酶SphI进行酶切→酶切体系为PCR产物10.0μL→10×H Buffer 2.0μL→SphI内切酶1.0μL→双蒸水7.0μL→体积20.0μL→37℃水浴消化。酶切后产物分析采用2%琼脂糖凝胶电泳法，产物电泳，凝胶成像系统判定结果。（4）序列分析：所有病例的PCR产物进行DNA序列测定。

1.3 统计学方法 所有数据均应用SPSS15.0统计软件处理，两组间各等位基因及基因型频率的比较采用χ2检验，单因素Logistic回归分析，关联程度用优势比（OR）及其95%可信区间（95%CI）表示。

2 结 果

2.1 MMP-9基因多态性检测 当MMP-9基因型为TT时，两个等位基因均有酶切位点,酶切产物电泳后有247bp和188bp两个片段。MMP-9基因突变标准：CC基因型（435bp）、CT基因型（435bp、247bp、188bp）、TT基因型（247bp、188bp），PCR酶切后电泳结果见图1（封三）。

2.2 MMP-9 PCR产物基因测序 CC、CT为MMP-9 1562位点两种基因型。CC纯合子测序相应位点为C单峰；CT杂合子测序结相应位点为C、T双峰。见图2～3（箭头所示为突变位点）（封三）。

2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验 对124例过敏性紫癜患儿MMP-9基因-1562C/T进行经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，结果符合平衡定律（χ2=0.814，P=0.326），表示样本具有群体代表性。

2.4 各组间MMP-9-1562 C/T基因型及等位基因频率比较 过敏性紫癜患儿肾损害组中MMP-9-1562CT基因型及T等位基因频率高于无肾脏损害组（P＜0.01），见表1；logistic回归分析示1562T等位基因可增加过敏性紫癜患儿发生肾脏损害（OR= 3.89，95%CI：1.36～11.44）。过敏性紫癜患儿胃肠道损害组和无胃肠道损害组中MMP-9-1562C/T基因型及等位基因频率无明显差异（P＞0.05），见表2。

表1 HSP肾脏损害组与无肾脏损害组患者的基因型及等位基因频率[例（%）]

表2 HSP胃肠道损害组与无胃肠道损害组患者的基因型及等位基因频率[例（%）]

3 讨论

过敏性紫癜（HSP）是以广泛的急性无菌性毛细血管和小动脉的炎性反应为基本病理改变的血管炎综合征。目前细胞外基质在HSP和紫癜性肾炎（henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN）发生、发展中的作用日益受到重视。MMP-9是一种由锌离子依赖性酶组成的能降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白的重要酶类，在调节基质降解方面发挥着重要的作用，它几乎能降解细胞基质的所有成分，也参与了相关组织的破坏和重建，与炎症反应、肿瘤扩散转移、新陈代谢、关节炎中的软骨破坏、动脉硬化等有关。MMP-9降解细胞外基质导致血管壁结构的完整性，促进血管炎症反应的发生，从而导致血管损害[4，6-7]。

基质金属蛋白酶的损伤是HSP血管炎发生和发展的关键因素。运用分子生物学技术对HSP的多种易感基因多态性分析表明，遗传因素在HSP的发生发展及其肾脏损伤过程中扮演重要角色。包含MMP-9-1562C/T多态性位点的9bp序列GCGCAC/ TGCC（-1567→-1559）是一个重要的调控元件，是MMP-9基因转录启动子上游的1562处存在的C被T取代，而1562位点基因多态性不引起氨基酸的改变。MMP-9浓度随其基因转录效率不同发生变化，从而影响一些相关疾病发生与发展[3，8]。张园海等[9]发现，MMP-9-1562C/T多态性与儿童川崎病的冠脉损害有关。

本研究发现，HSP患儿胃肠道损害组和无胃肠道损害组中MMP-9-1562C/T基因型及等位基因频率无明显差异；HSP患儿肾损害组中MMP-9-1562CT基因型及T等位基因频率比无肾脏损害组明显升高；单因素Logistic回归分析也显示-1562T等位基因是HSP患儿发生肾脏损害的危险因素。这从遗传基因水平揭示了MMP-9对HSP肾损害的作用，为其治疗提供了新的靶点。

［1］Danilewicz M，Wagrowska-Danilewicz M.Differential glomerular immunoexpression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in idiopathic IgA nephropathy and Schoenlein-Henoch nephritis［J］.Folia Histochem Cytobiol，2010，48（1）：63-67.

［2］Raffetto JD，Khalil RA.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease［J］. Biochem Pharmacol，2008，75（2）：346-359.

［3］Zou CC，Zhao ZY，Tang LF，et al.Plasma levels of matrix metalloproteinase-9 in Henoch-Schonlein purpura［J］. ScandJ Rheumatol，2006，35（1）：52-55.

［4］Xu J，Zhu D，Sonoda S，et al.Over-expression of BMP4 inhibits experimental choroidal neovascularization by modulating VEGF and MMP-9［J］.Angiogenesis，2012，15（2）：213-227.

［5］胡亚美.诸福棠实用儿科学［M］.北京：人民卫生出版社，2005：456.

［6］Chiang IT，Liu YC，Wang WH，et al.Sorafenib inhibits TPA-induced MMP-9 and VEGF expression via suppression of ERK/NF-κB pathway in hepatocellular carcinoma cells［J］. In Vivo，2012，26（4）：671-681.

［7］Xu HM，Zhao Y，Zhang XM，et al.Polymorphisms in MMP-9 and TIMP-2 in Chinese patients with varicose veins［J］.J Surg Res，2011，168（1）：e143-148.

［8］Ye S.Polymorphism in matrix metalloproteinase gene promoters:implication in regulation of gene expression and susceptibility of various diseases［J］.Matrix Biology，2000，19：623-629.

［9］张园海，李丰，徐强，等.基质金属蛋白酶-9基因-1562C/ T多态性与川崎病冠脉损害及丙种球蛋白耐药的关系［J］.医学研究杂志，2013，42（4）：136-139.

（收稿：2015-12-16 修回：2016-01-24）

浙江省温州市科技计划项目（No.Y20140252）

浙江省苍南县人民医院儿科（苍南 325800）

方全中，Tel：13566114288