微小RNA在叉头转录因子M1激活非小细胞肺癌上皮向间质转化中的作用

2016-02-09 09:22邹黎菲惠复新汪家坤
中国临床医学 2016年6期
关键词:荧光素酶靶向试剂盒

吴 艳, 邹黎菲, 惠复新, 汪家坤

南京医科大学附属无锡人民医院呼吸科,无锡 214023

论 著

微小RNA在叉头转录因子M1激活非小细胞肺癌上皮向间质转化中的作用

吴 艳, 邹黎菲, 惠复新, 汪家坤*

南京医科大学附属无锡人民医院呼吸科,无锡 214023

目的:探讨微小RNA(microRNA)在叉头转录因子M1(Fox M1)激活非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞上皮向间质转化(epithelial-mesenehymal transition,EMT)中的作用。方法:将Fox M1过表达质粒,Fox M1-shRNA,miR-539、miR-485-5p模拟物及其抑制物转染至人NSCLC细胞株中,应用Western印迹和real-time PCR检测细胞株中Fox M1蛋白和mRNA及miR-539、miR-485-5p的表达。同时应用CCK-8和细胞迁移实验观察Fox M1、miR-539和 miR-485-5p对NSCLC细胞的增殖和侵袭功能的影响。应用荧光素酶报告基因实验检测miR-539和 miR-485-5p与EMT调控蛋白ZEB1和Snail1的关系。结果:Fox M1过表达下调NSCLC 细胞中miR-539、miR-485-5p,转染Fox M1-shRNA后NSCLC细胞中 miR-539、miR-485-5p升高。MiR-539和miR-485-5p抑制Fox M1对NSCLC细胞增殖和侵袭的促进作用。NSCLC细胞中miR-539对EMT调控蛋白ZEB1,miR-485-5p对EMT调控蛋白Snail1的表达有抑制作用。结论:miR-539和miR-485-5p能抑制NSCLC细胞中Fox M1-EMT通路,从而影响NSCLC细胞的增殖和侵袭,抑制NSCLC的远处转移。

叉头转录因子M1;上皮向间质转化;非小细胞肺癌;微小RNA

恶性肿瘤是我国城市居民死亡的首位原因,占全部死亡总数的25%,肺癌已替代肝癌成为我国恶性肿瘤的首位死亡原因。肺癌的远端转移是肺癌患者的主要死亡原因[1]。肺癌中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占所有肺癌的85%,其临床症状重,预后差[2-3]。目前,应用于临床的靶向治疗药物可使NSCLC患者的生存期明显延长,生活质量显著提高。但这些药物治疗的靶点局限,且仅对小部分患者有效,因此急需寻找新的治疗靶点。Fox (forehead box) M1是Fox转录因子家族的成员。研究[4]表明,Fox M1与NSCLC患者的不良预后密切相关。Fox M1的过表达能促进NSCLC肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[5]。而EMT在多种肿瘤的转移中发挥重要作用[6]。研究[7]发现,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在Fox M1促进 NSCLC肿瘤细胞迁移和侵袭能力中亦发挥关键作用。研究[8-9]证实,miRNA在NSCLC中具有重要的调节作用。miR-663a在NSCLC组织中下调,并且通过靶向JunD作为肿瘤抑制剂起作用[10]。MiR-223通过靶向胰岛素样生长因子-1受体增强NSCLC细胞对厄洛替尼的敏感性[11]。Fox M1-EMT是涉及多个信号通路和分子调节机制的复杂过程,这个调控网络中不仅包含一些蛋白分子、调控因子信号的调控,还受到miRNA的调控。因此,本研究通过观察miR-539、miR-485-5p对NSCLC细胞中Fox M1-EMT信号通路的影响,为NSCLC靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人NSCLC细胞系A549和H1299购自中国科学院上海细胞库(中国上海),并用含10%胎牛血清(FBS,Hyclone,美国)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM,Invitrogen,美国)在37℃、5%CO2的湿润培养箱中培养。

1.2 细胞转染 Fox M1过表达质粒、Fox M1抑制剂(Fox M1-shRNA,Genepharma,中国),使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,美国)根据说明书分别转染至NSCLC细胞中。NSCLC细胞分别转染miR-539、miR-485-5p 模拟物(mimic)和对照miRNA(Genepharma,中国),应用Lipofectamine 2000以50 nmol/L浓度转染。同样,miR-539、miR-485-5p抑制剂(inhibitor)和对照(Genepharma,中国)根据说明书使用Lipofectamine 2000以100 nmol/L浓度转染入NSCLC细胞中。

1.3 qRT-PCR 用TRIzol试剂(Invitrogen,美国)从细胞中提取总RNA,并通过NanoDrop ND-1000分光光度计(Agilent,美国)测量浓度。ABI 7500系统(Applied Biosystems,美国)进行qRT-PCR。反转录和qRT-PCR扩增用具有gDNA Eraser(TaKaRa,日本)和SYBR Prime Script RT-PCR试剂盒(TaKaRa,日本)的PrimeScript RT试剂盒。MiRNA的反转录和qRT-PCR扩增使用miDETECA TrackTMmiRNA qRT-PCR入门试剂盒(Rib Bio,中国)。以β-actin作为内参,miRNA以U6作为内参。每个实验进行至少3次。qRT-PCR的引物如表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.4 免疫印迹法 将NSCLC细胞裂解并用1×SDS-PAGE上样缓冲液提取到蛋白质中。使用BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology,中国)测定蛋白质浓度。在10%SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质,然后转移至PVDF膜。在用5%脱脂乳封闭2 h后,用如下的第一抗体温育膜:Fox M1(1∶250,Santa Cruz,美国)和β-actin(1∶1 000,Santa Cruz,美国)。

1.5 CCK-8测定 使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定试剂盒(Dojindo,日本)测定细胞增殖。将转染的细胞以2×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中;第2 d向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液。将细胞孵育70 min,并使用酶联免疫吸附测定读数器(Dasit,意大利)测试450 nm处的光密度值,共6 d,每个实验进行至少3次,并分析结果的平均值。

1.6 细胞迁移测定 将无血清培养基中的转染的NSCLC细胞以合适的密度接种在具有8 mm直径(Corning,美国)的24孔格式的Transwell室的上部。在底室中,加入800 μL含有10%FBS的正常DMEM培养基,并将培养箱在37℃、5%CO2下培养24~48 h。用棉签轻轻擦去上部的细胞,并将迁移的细胞用0.05%结晶紫染色30 min。在显微镜下5个随机视野中计数迁移的细胞,每个实验进行至少3次,分析结果的平均值。

1.7 荧光素酶报告基因测定 将含有完整miR-539识别序列的ZEB1的3′-UTR和含有完整miR-485-5p识别序列的Snail13′-UTR克隆到pmiR-RB-ReportTM(Rib Bio,中国)中。将细胞(5×104)接种在24孔板中并孵育24 h后进行转染。应用Lipofectamine 2000转染包含miRNA(miR-539和miR-485-5p)模拟物以及阴性对照的3′-UTR(或3′-UTR-突变体)的萤火虫荧光素酶构建体。转染48 h后裂解细胞,提取蛋白,用Dual-Luciferase Reporter System(Promega,中国)测量荧光信号变化。

1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 6.0进行统计分析。两组间的差异通过Student’sttest进行检验。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 Fox M1下调NSCLC 细胞中miR-539、miR-485-5p mRNA的水平 通过转染过表达Fox M1的质粒及Fox M1的shRNA,结果显示不同NSCLCs细胞株Fox M1的mRNA及蛋白水平均能稳定地显示Fox M1高表达及低表达特性(图1A~1D)。MiR-539、miR-485-5p mRNA水平在不同的NSCLC细胞系中均表现为在Fox M1高表达时降低,在Fox M1被抑制时升高(图1E、1F)。

图1 NSCLC细胞系A549和H1299中Fox M1过表达或表达抑制对miR-539、miR-485-5p mRNA表达的影响

2.2 miR-539和miR-485-5p抑制Fox M1对NSCLC细胞增殖和侵袭的影响 本研究通过转染miR-539和miR-485-5p,使NSCLC细胞过表达miR-539和miR-485-5p,并检测CCK-8及细胞迁移能力来观察miR-539和miR-485-5p的过表达对NSCLC细胞增殖和侵袭的影响,发现miR-539和miR-485-5p过表达抑制NSCLC细胞增殖和侵袭(图2A、2B)。相反,抑制miR-539和miR-485-5p增强了NSCLC细胞增殖和侵袭的促进作用(图2C、2D)。在过表达Fox M1的细胞中,miR-539和miR-485-5p过表达抑制Fox M1对NSCLC细胞增殖和侵袭的促进作用,抑制miR-539和miR-485-5p的表达增强Fox M1对NSCLC细胞增殖和侵袭的促进作用(图3)。

图2 miR-539和miR-485-5p对NSCLC细胞(H1299)增殖和侵袭能力的影响

A, B: miR-539和miR-485-5p对H1299细胞增殖的抑制作用;C, D: miR-539和miR-485-5p对H1299细胞迁移能力的抑制作用.NC: normal control; miR-539: miR-539 mimic; miR-485-5p: miR-485-5p mimic.*P<0.05, **P<0.01;n=3

2.3 NSCLC细胞中miR-539对ZEB1以及miR-485-5p对 Snail1的调控 通过生物信息学方法,本研究发现miR-539 能结合 ZEB1的3′-UTR区,miR-485-5p能与Snail1的3′-UTR结合(图4A)。为了了解miR-539和miR-485-5p是否能分别调控ZEB1和Snail1,我们通过基因转染的途径在NSCLC细胞中过表达或抑制miR-539和miR-485-5p时发现Fox M1的蛋白和mRNA水平升高或降低(图4B~4E)。同时将3′-UTR ZEB1和Snail1含有野生型或突变型miR-539和miR-485-5p结合序列分别克隆到荧光素酶报告基因载体中并将载体同时转染入细胞后,荧光素酶报告基因实验证明,miR-539和miR-485-5p能有效抑制野生型荧光素酶活性而对突变型荧光素酶活性无影响(图4F)。

图3 miR-539和miR-485-5p对 Fox M1对NSCLC细胞(H1299)增殖和侵袭能力的抑制作用

A, B: miR-539和miR-485-5p抑制H1299细胞中Fox M1对H1299增殖的影响; C, D: miR-539和miR-485-5p抑制H1299细胞中Fox M1对H1299迁移能力的影响.a, d: Fox M1+NC; b: Fox M1+miR-539 mimic; c: Fox M1+miR-539 inhibitor; e: Fox M1+miR-485-5p mimic; f: Fox M1+miR-485-5p inhibitor.*P<0.05,**P<0.01;n=3

图4 H1299细胞中miR-539对ZEB1以及miR-485-5p对 Snail1的调控

A: miR-539 能结合 ZEB1的3′-UTR区, miR-485-5p能与Snail13′-UTR 结合; B, C: miR-539 和miR-485-5p过表达对H1299细胞中Fox M1的蛋白水平(B)及mRNA水平的影响(C); D, E: miR-539 和 miR-485-5p的抑制对H1299细胞中Fox M1的蛋白水平(D)和mRNA水平(E)的影响; F: miR-539和miR-485-5p过表达能有效抑制野生型荧光素酶活性而对突变型荧光素酶活性无影响.*P<0.05,**P<0.01;n=3

3 讨 论

miRNA 是一类广泛存在于动植物和病毒中长为20~25个核苷酸的内源性小分子非编码RNA。研究[12]发现 miRNA与肺癌的类型、进展、患者预后及生存率密切相关。 MiRNA 可作为肿瘤抑制或促进因子调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和癌性血管生成等。研究[13-16]发现miR-485-5p、miR-539在多种肿瘤中均有明显下调,可作为肿瘤恶化的抑制因子。MiR-485-5p可能成为NSCLC早期诊断的标志物[17],而miR-539能增强顺铂对非小细胞肺癌耐药株的杀伤作用[18]。在这项研究中,我们发现在NSCLC细胞中Fox M1上调EMT可能是通过抑制miR-539和miR-485-5p的表达发挥作用。

本研究发现,在NSCLC细胞株中Fox M1的表达抑制miR-539、 miR-485-5p。 miR-539、 miR-485-5p mRNA在Fox M1高表达时降低,在Fox M1表达被抑制时升高。功能实验发现miR-539和miR-485-5p过表达时NSCLC细胞的增殖和迁移能力减弱,miR-539和miR-485-5p被抑制时细胞的增殖和迁移能力增强。在过表达Fox M1的H1299细胞内,miR-539和miR-485-5p能抑制由于Fox M1导致的细胞侵袭和增殖能力的增强。因此,miR-539和miR-485-5p可能是通过Fox M1来调控NSCLC细胞的功能。

研究[19]发现,Fox M1通过EMT促进 NSCLC肿瘤细胞迁移和侵袭。研究[20]表明,肺癌EMT过程受到多种miRNA调控,miR-138通过靶向GIT1和SEMA4C抑制非小细胞肺癌细胞的细胞增殖和逆转EMT。MiR-145和miR-203通过抑制非小细胞肺癌细胞中的SMAD3抑制TGF-β诱导的EMT[21],miR-338-3p通过靶向EMT抑制肺癌细胞的转移[22]。然而miR-539和miR-485-5p是否能通过Fox M1-EMT途径来调控NSCLC细胞功能尚未可知。多项研究[23-24]证实ZEB1和Snail1是调控EMT的重要蛋白。Fox M1能通过激活ZEB1和Snail1等促进肿瘤细胞EMT过程[25-27]。实验通过生物信息分析发现,miR-539 能结合 ZEB1的3′-UTR区,miR-485-5p能与Snail13′-UTR 结合。荧光素酶报告基因实验发现,miR-539和miR-485-5p的过表达能分别抑制ZEB1和Snail1的表达,参与调控NSCLC细胞的Fox M1-EMT通路。

综上所述,本研究证实miR-539和miR-485-5p能通过调控Fox M1-EMT通路来影响NSCLC肿瘤细胞增殖和侵袭能力,影响肿瘤的远处转移,为临床NSCLC的诊治提供了新的理论依据。

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[本文编辑] 叶 婷, 晓 璐

The role of microRNAs in activation of epithelial-mesenchymal transition in non-small-cell lung cancer by forkhead box M1

WU Yan, ZOU Li-fei, HUI Fu-xin, WANG Jia-kun*

Department of Respiratory Medicine, Wuxi People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Wuxi 214023, Jiangsu, China

Objective:To investigate the role of microRNAs in Fox M1-induced non-small cell lung cancer (NSCLC) epithelial-mesenchymal transition (EMT).Methods:Over expression Fox M1plasmid, Fox M1-shRNA, miR-539, miR-485-5p mimics and inhibitor were transfected into NSCLC cells.The expression of Fox M1protein and mRNA, miR-539 and miR-485-5p were detected by Western blotting and real-time PCR.The CCK-8 and cell migration was used to observe the effect of Fox M1, miR-539 and miR-485-5p on the proliferation and invasion of NSCLC.Luciferase reporter assay was used to explore the relationship between miRNA( miR-539 and miR-485-5p) and EMT regulatory protein (ZEB1and Snail1).Results:Real-time RT-PCR and Western blotting showed Fox M1over expression inhibited the expression of miR-539, miR-485-5p, miR-539 and miR-485-5p in NSCLC cells were increased after transfected Fox M1-shRNA.MiR-539 and miR-485-5p suppressed enhancement of proliferation and invasion of NSCLC cells by Fox M1.miR-539 targeted and inhibited the translation of ZEB1,miR-485-5p targeted and inhibited the translation of Snail1in NSCLC cells.Conclusions:The mechanism of Fox M1up-regulation of EMT protein is to decrease the expression of miR-539 and miR-485-5p in NSCLC cells, thus to affect the proliferation and invasion of NSCLC cells, and to inhibit distant metastasis.

forkhead box M1; epithelial-mesenchymal transition; NSCLC; microRNA

2016-09-26[接受日期]2016-11-30

吴 艳,硕士,副主任医师.E-mail: wuyanyangting@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0510-85350137, E-mail: wwwztg90203@sina.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160990

R 734.2

A

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