以Hsp90为靶点治疗真菌感染的研究进展和展望

杨苏腾 廖勇 巴根 吕雪莲 杨蓉娅(北京军区总医院(第二军医大学临床教学医院)皮肤科,北京100700)



以Hsp90为靶点治疗真菌感染的研究进展和展望

杨苏腾 廖勇 巴根 吕雪莲 杨蓉娅
(北京军区总医院(第二军医大学临床教学医院)皮肤科,北京100700)

【摘要】为了增强抗真菌药物的效能并避免真菌耐药,以分子伴侣Hsp90作为药物靶点是一个新的有前途的策略。对于系统性真菌感染,如果想要达到有效的联合用药效果,就需选择对病原真菌Hsp90有特异性作用的抑制剂。本文总结了Hsp90与病原真菌耐药的关系和对真菌毒力特征的调节,Hsp90功能的调节及其客户蛋白,并讨论了为治疗真菌感染而研发Hsp90抑制剂所面临的挑战。

【关键词】医学真菌;抗真菌药物;真菌耐药性;热休克蛋白

[Chin J Mycol,2016,11(1):53-57]

全世界每年有数以亿计的感染病原真菌的患者,导致每年至少150万人的死亡。因癌症化疗、移植后的免疫抑制治疗以及艾滋病而导致免疫功能低下的人群持续增长,进而引起真菌感染发病率不断升高[1]。即使临床上应用现行的治疗指南,系统性真菌感染导致患者的病死率仍超过50%[1]。目前有效的抗真菌药物种类有限,真菌细胞与人类宿主细胞同为真核细胞,这就限制了药物靶点的选择,并可能使药物对人体产生细胞毒性。病原真菌耐药性的出现,降低了临床使用抗真菌药物的疗效。美国疾病预防与控制中心的报告指出,对唑类耐药的念珠菌每年导致约46 000例感染,而这些血源性感染的患者中约30%在住院治疗期间死亡[2]。

近年来研发抗真菌药物的新思路中,其中一种就是以细胞应激反应的关键调节物质作为药物靶点。Cowen等[3]发现了真菌依靠应激反应以对抗真菌药对细胞膜和细胞壁损伤的机制,并推测阻断细胞应激反应信号通路可以避免真菌耐药并显著增加抗真菌药物疗效,包括以热休克蛋白Hsp90作为靶点的途径[4]。Hsp90是一种高度保守的分子伴侣,它能够调节细胞稳态和激活多种客户蛋白并在细胞应激通路中发挥重要的效应,是最常见的调节因子[5]。本文讨论的是利用Hsp90作为药物靶点治疗人类真菌病的研究进展和应用前景。

1 真菌Hsp90的发现历程

Hsp90作为抗真菌药物靶点的发现,最初是从研究其与动植物遗传变异的关系开始,进而引发对其在真菌稳定性和快速适应性耐药中的研究兴趣。1998年,Rutherford等学者证实了在果蝇体细胞中,Hsp90能够缓冲遗传变异的表达从而使果蝇的表型趋于稳态,具有电容器一样的特性[6]。应激反应增加细胞中错误折叠蛋白的数量,消耗大量Hsp90,这样将提高触发遗传变异的概率,因此通过抑制Hsp90能够使隐性遗传变异显现出来。经过后天的环境选择,新特性不依赖Hsp90而保留,而是被同化为后代群体的表型[7],也有人通过研究植物得到类似的结果[8]。

Hsp90在基因突变中的功能是多面的,它既可以缓冲基因突变以延缓其表现,也可能加快某些环节,促进新表型的出现;在外界环境的影响下, Hsp90能够随机地调节基因表达。Cowen等人[9]的研究证实,抑制Hsp90功能可阻断酿酒酵母快速适应性耐药的形成,并解除传代变异所获得的较稳定的耐药性。Hsp90参与大约20%的隐性基因突变的表达,因此,有必要去研究它在真菌生物学和相关疾病中所起的不同作用[10]。

2 病原真菌Hsp90与耐药

目前,致病真菌的耐药主要是针对唑类和棘白菌素类这两种不同靶点的药物,由于在不同真菌中Hsp90促进病原真菌耐药形成的功能是相对保守的,所以研究Hsp90与这两类药物在对抗病原真菌中的关系就显得尤为重要。念珠菌属是医院获得性感染第四大病因,关于这类菌的Hsp90与耐药作用研究也最广泛[11]。作为系统性念珠菌病的最主要病原体,抑制白念珠菌的Hsp90可阻断其对唑类快速适应性耐药的形成而提高药效,并且解除传代进化形成的较稳定的唑类耐药性[9]。在白念珠菌致死性感染的大蜡螟动物模型的研究中,烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG)可以提高唑类的效能[12]。此外,在系统性念珠菌感染的小鼠模型中,通过减少白念珠菌Hsp90基因的表达,能提高氟康唑的效能[12]。同样,在对念珠菌和曲霉的研究中证实真菌对棘白菌素类药物耐药也与Hsp90相关[12-14]。在体外实验中,Hsp90抑制剂和棘白菌素类联用时可以解除烟曲霉对唑类的耐药性[15]。比起单独应用棘白菌素类,联用Hsp90抑制剂可以提高大蜡螟在感染烟曲霉后的生存率[12],同样在小鼠侵袭性感染的动物模型中,降低白念珠菌Hsp90基因表达可以提高棘白菌素类药物的疗效[13]。

对于大多数病原真菌,细胞群体结构改变也可能导致耐药性的出现,其中的真菌生物膜与对抗真菌药的高度耐药密切相关[16]。在体外实验中,抑制白念珠菌Hsp90功能会减少生物膜形成,削弱对唑类的耐药性,并阻断生物膜脱落细胞的播散,类似结果在烟曲霉生物膜细胞的研究中也得到证实[17]。在大鼠中央静脉置管的生物膜感染模型中,单独应用唑类是无效的,但敲除致病真菌Hsp90基因或采用其抑制剂,则有利于清除导管上的真菌,使其丧失毒力[17]。最近的研究更提示Hsp90与真菌生物膜细胞某些转录因子活性的调节有关[18]。

3 病原真菌Hsp90与毒力

除了与真菌耐药相关,Hsp90也是真菌毒力的一个重要调节因子,目前主要研究其在菌相转化中的作用。在白念珠菌酵母相与菌丝相的相互转化中,Hsp90起到关键的作用[19]。真菌在组织间侵袭、逃避巨噬细胞以及表达毒力因子(比如黏附能力和蛋白酶)的过程中,菌丝相发挥了重要作用;而酵母相被认为与早期感染以及播散感染相关[20]。研究发现在更有利于酵母相生长的环境条件下,抑制Hsp90的功能可促进白念珠菌向菌丝相转换[21]。高温抑制了Hsp90的功能,因此减弱了后者对菌丝相转换的抑制。基因层面的研究也证实敲除白念珠菌的Hsp90基因会减弱其在系统感染的小鼠模型中的毒力[21]。

4 Hsp90的调节因子

作为细胞应激反应的一个关键节点,Hsp90功能的实现受到上游通路多种分子调节。Hsp90功能的调节是通过ATP的结合与水解,分子伴侣以及磷酸化、乙酰化等表达后修饰而实现的[22-23]。这些修饰会改变Hsp90的构型,从而影响其对客户蛋白的识别和伴侣功能。近来的研究认为翻译后修饰是一种调节白念珠菌Hsp90功能的关键因素。同酿酒酵母以及哺乳动物相似[24],白念珠菌中Hsp90的功能受蛋白激酶CK2调节[25]。通过降低CK2调节亚基的表达,可减少Hsp90及其伴侣分子Cdc37的磷酸化,从而抑制客户蛋白的稳定性和功能[25]。此外,乙酰化则是对Hsp90基因翻译后的另一种修饰[26],利用曲古抑菌素A抑制赖氨酸去乙酰酶抑制剂(KDACs),会破坏多种客户蛋白的稳定性并解除酿酒酵母及白念珠菌对唑类的耐药性[27]。酿酒酵母中对耐药有重要影响的KDACs是Hda1和Rpd3[27],然而在白念珠菌中的功能有待进一步确定。实验发现白念珠菌中Hsp90的一种协同伴侣分子Sgt1蛋白会影响前者的生理功能,抑制Sgt1则会间接抑制Hsp90的功能,包括解除耐药性和抑制菌丝化[28]。

5 Hsp90的客户蛋白

Hsp90的不同客户蛋白也从各个方面调节细胞应激反应。白念珠菌中被鉴定的第一个客户蛋白是钙调神经磷酸酶(Ca N)[9],后者是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,是调节唑类和棘白菌素类药物耐药的关键因子[13]。在酿酒酵母和白念珠菌中,Hsp90与Ca N的调节亚基相互作用而发挥生理功能,而敲除Hsp90基因则会导致CaN的表达下降[13]。免疫抑制剂环孢菌素A和他克莫司(FK506)是两种不同结构的CaN抑制剂,已被证实都可以解除多种病原真菌的耐药性[15]。研究也发现CaN在调节念珠菌和烟曲霉毒力中发挥了关键作用[29-30]。在白念珠菌中,细胞完整性相关蛋白Mkc1调节唑类和棘白菌素类的耐药性表达。Hsp90能够稳定Mkc1,以保证由抗真菌药触发的重要应激反应[31]。与白念珠菌中Hsp90能够同时稳定磷酸化和非磷酸化的Mkc1不同[31],酿酒酵母的Hsp90特异性地抑制与Mkc1同源的磷酸化形式的Slt2[32]。类似的实验证实,通过对这种Hsp90参与的细胞壁完整性相关的通路信号传递的抑制,可以减弱念珠菌耐药性和毒力[31]。而在新生隐球菌中,Pkc1参与的信号通路与毒力调节相关[33]。

6 Hsp90的抗体

除了通过化学药物抑制真菌Hsp90,科学家们还试图从免疫应答中寻找办法,利用真菌Hsp90的单克隆抗体去阻断其功能。诺华公司研发出重组人Hsp90单克隆抗体Efungumab。该药动物实验的研究显示其与卡泊芬净、氟康唑以及两性霉素B联用均显示了协同效应,随后的随机临床研究中,Efungumab与两性霉素B联用治疗侵袭性念珠菌病也表现出了协同效用[34]。但考虑到药品安全与生产质量,诺华公司最终停止了该药的继续研发[35]。作为Efungumab的衍生物,尽管Mycograb C28Y的安全性与耐受性都较前者有所改善,但在侵袭念珠菌病的小鼠模型试验中却未见疗效[36]。另外,在对烟曲霉感染的治疗上,涉及Efungumab的文献报道比较少见,而Mycograb C28Y对烟曲霉的药效欠佳[37]。这提示Hsp90抗体在治疗真菌感染的有效性与安全性上还有待进一步研究与论证。

7 研发面临的挑战

由于Hsp90在物种间的高度保守性,研究用于治疗真菌感染的Hsp90抑制剂依然面临挑战。比如,17-AAG在联合唑类药物治疗真菌生物膜感染的动物模型是高效而又低毒性的[17],这是因为在血流的液阻效应影响下,药物作用和真菌致病部位都是局限于动物体内局部的导管环境中。相反地,该药被系统应用以治疗播散性白念珠菌感染的动物模型时,达到疗效的药物浓度就会带来严重毒性[12]。为了解决这种问题,科学家们的一种设想就是研发出对真菌有特异性的Hsp90抑制剂以减轻对宿主的毒性[38]。而Lamoth等[39]在最近的体外药敏实验中,发现不同的Hsp90抑制剂在针对同一种曲霉时所体现的抑制作用是有区别的,这提示我们也可从现有的药物中进行筛选出不同真菌特异性的Hsp90抑制剂。

病原真菌中的Hsp90与人类同源体存在结构性差异,其对应的腺苷三磷酸酶(ATPase)也有活性差异,若这些差异被研究清楚,将会更好地指导研发真菌病原特异性的Hsp90抑制剂[40]。另一方面,尽管Hsp90高度保守,但其协同伴侣分子以及效应蛋白也存在种属间特异性;而近年来通过化学基因组方法对白念珠菌的研究,发现了许多新的Hsp90上下游作用物与耐药性和毒力相关,从而可作为新的治疗靶点[25],综上,研发选择性作用于真菌Hsp90的治疗药物具有广阔的前景。

8 小 结

作为真菌耐药、应激反应、形态转换以及毒力相关的细胞通路枢纽,科学家们已认识到Hsp90是真菌细胞功能中的关键角色。尽管已有现成用于临床试验治疗癌症的Hsp90抑制剂可供选择,考虑到全身用药可能带来的宿主毒性问题,仍需研发真菌特异性的Hsp90抑制剂[12]。另一种选择就是以Hsp90上下游功能的蛋白为靶点,这类分子在宿主与病原真菌之间差异性更明显,比如伴侣分子、KDACs和钙调神经磷酸酶等,有望在联合用药治疗中发挥可观的作用[38]。另外,Hsp90抗体的研究,似乎也开辟了一条新的途径。同时,通过加强制药业和真菌研究学者之间的合作,将会有效促进Hsp90抑制剂和其他相关药物的研发,尽快减少由真菌感染所带来的全球健康经济负担。

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[本文编辑]施 慧

·消息·

Research progress on targeting Hsp90 for antifungal therapy

YANG Su-teng,LIAO Yong,BA Gen,LV Xue-lian,YANG Rong-ya
(Department of Dermatology,General of Hospital of Beijing Military Command(Second Military Medical University),Beijing 100700,China)

【Abstract】A promising new strategy to enhance the efficacy of antifungal drugs and block the evolution of drug resistance is to target the molecular chaperone Hsp90.For systemic infections,however,effective combination therapy regimens may require Hsp90 inhibitors that can select target Hsp90 in the pathogen.In this review,we summarize studies of the impact of Hsp90 on drug resistance of fungal pathogens and regulation of key fungal virulence traits,regulator of Hsp90 function and the client proteins,and discuss the challenges for development of Hsp90 inhibitors to treat fungal infections.

【Key words】fungus;antifungal agents;drug resistance;heat shock protein 90

[收稿日期]2015-10-15

通讯作者:杨蓉娅,E-mail:yangrya@vip.sina.com

作者简介:杨苏腾,男(汉族),硕士研究生在读.E-mail:stone_ young@sina.cn

基金项目:国家自然科学基金(81301410)

【中图分类号】R 978.5

【文献标识码】A

【文章编号】1673-3827(2016)11-0053-05