血清载脂蛋白B椭偏光蛋白质芯片技术定量检测的条件优化

宁翔，王娇娇，王娟，毕少杰，盛林

(1山东大学第二医院，济南250033；2山东大学齐鲁医院)

血清载脂蛋白B椭偏光蛋白质芯片技术定量检测的条件优化

宁翔1，王娇娇2，王娟1，毕少杰1，盛林1

(1山东大学第二医院，济南250033；2山东大学齐鲁医院)

目的 优化椭偏光蛋白芯片技术定量检测血清载脂蛋白B(ApoB)的条件，并观察最佳条件下椭偏光蛋白芯片技术定量检测血清ApoB的准确性。方法 用椭偏光蛋白芯片技术检测含有0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的载脂蛋白B抗体(anti ApoB)和200 μg/mL ApoB标准品的溶液，测得灰度值最高者选为最佳anti-ApoB浓度。用椭偏光蛋白芯片技术检测5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB标准品溶液，anti- ApoB浓度为0.3 mg/mL，结果以灰度值表示。然后在上述标准品溶液中加入蛋白G使其终浓度为0.1 mg/mL，再检测一次灰度值。比较两次检测的灰度值，确定是否应该加入0.1 mg/mL蛋白G。最佳条件下椭偏光蛋白芯片技术检测0、5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB标准品溶液，计算上述ApoB标准品溶液灰度值与不含ApoB的空白探针溶液(含anti ApoB和蛋白G)灰度值的差值。对上述ApoB标准品溶液浓度和灰度值差值的相关性进行分析，以ApoB标准品溶液浓度为横坐标，灰度值差值为纵坐标描画标准曲线并建立方程。最佳条件下用椭偏光蛋白芯片技术检测16份40倍稀释的已知ApoB浓度(采用免疫比浊法测定)血清的灰度值两次。用上述方程计算16份血清中ApoB浓度，并与其实际ApoB浓度比较。结果 最佳anti-ApoB浓度为0.3 mg/mL。与不应用蛋白G者相比，应用0.1 mg/mL蛋白G的椭偏光蛋白芯片技术测得样品的灰度值高(P均<0.05)。以ApoB浓度为横坐标x、灰度差值为纵坐标y描画标准曲线，Maple9.5软件得出的回归方程为：y=-23.116Ln(1-x/60)，R2=0.936 4。16份血清ApoB浓度和第一次、第二次用椭偏光蛋白芯片技术检测测得血清ApoB浓度相比P均>0.05。结论 椭偏光蛋白芯片技术检测血清ApoB的最佳条件为anti-ApoB浓度0.3 mg/mL，蛋白G浓度0.1 mg/mL。此条件下椭偏光蛋白芯片技术检测血清ApoB结果准确。

椭偏光蛋白芯片技术；光学蛋白质芯片；椭偏光生物显微成像技术；载脂蛋白B；载脂蛋白B抗体；蛋白G

载脂蛋白B(ApoB)是致动脉硬化脂蛋白，即极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和中密度脂蛋白(IDL)的主要成分。血清ApoB在预估心脑血管疾病风险和诊断高脂蛋白血症、异常脂蛋白血症(如高ApoB血症等)方面有重要临床意义。但是由于ApoB的检测方法没有标准化，其临床应用不多。椭偏光蛋白芯片技术是光学蛋白质芯片技术和椭偏光学生物显微显像技术的结合的一项新技术，已被用于检测可溶性 Tie-2 、肿瘤标志物CA15-3等，但尚未见用椭偏光蛋白芯片技术检测血清ApoB的研究，其中配基载脂蛋白B抗体(anti-ApoB)和蛋白G的最佳浓度及其检测效果更不明确。本研究对椭偏光蛋白芯片技术检测血清ApoB的条件进行了优化，并在最佳条件下用椭偏光蛋白芯片技术检测已知ApoB浓度血清中的ApoB，观察检测结果准确性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 椭偏光学生物显微成像系统、光学蛋白质芯片分析系统及软件(EIES2003软件包)、微流道生物反应器系统(微阵列块、微流道块、盖板和多通道蠕动泵)、超净工作台均由中国科学院力学研究所微重力实验室制造并提供。单晶抛光硅片购自洛阳单晶硅片厂；单克隆山羊抗人载脂蛋白B抗体(anti-ApoB)和人载脂蛋白B(ApoB)标准品均购自USBiological公司；蛋白G和人血清白蛋白(HSA)均购自Sigma公司。上述蛋白均用1%的PBST液溶解和稀释。表面活性剂(NE)配比为0.05 mol/L 1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基一碳二亚胺盐酸盐和0.2 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液。16例健康查体者的血清由山东省内分泌代谢病研究所检验科提供，其中ApoB的浓度为免疫比浊法检测所得。

1.2 椭偏光蛋白芯片技术检测ApoB时anti-ApoB和蛋白G浓度的优化

1.2.1 anti-ApoB浓度的优化 首先进行芯片表面羧基化改性：将切好的抛光硅片用去离子水洗净，加入体积比为1∶3的过氧化氢和浓硫酸混合液，置于摇床轻微振荡30 min。无水乙醇洗净，并加入体积比为1∶15的3-氨基丙基三乙氧基硅烷无水乙醇混和液，置于摇床轻微振荡2 h。无水乙醇洗净，加入琥珀酸酐乙醇饱和溶液，置于摇床轻微振荡过夜。无水乙醇洗净，并封存待用。每个芯片微通道均加入10 μL表面活化剂(NE)，以4 μL/min的流速与芯片反应。配制5份200 μg/mL的ApoB标准品溶液，每份20 μL，在其中加入anti-ApoB使其终浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。将上述溶液以2 μL/min的流速与芯片反应10 min。用10 mg/mL HSA溶液30 μL以1 μL/min的流速封闭30 min，用PBST与去离子水50 mL再清洗一次。反应结束后去离子水冲洗芯片表面，氮气吹干，放置在光学椭偏显微成像系统检测平台上，EIES2003软件包观测和读取灰度值。比较各组灰度值，灰度值最高者对应的anti-ApoB浓度为最佳anti-ApoB浓度。

1.2.2 蛋白G浓度的优化 用上述方法检测5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB标准品溶液的灰度值，anti-ApoB浓度为0.3 mg/mL。然后在上述标准品溶液中加入蛋白G使其终浓度为0.1 mg/mL，再检测一次灰度值。比较两次检测的灰度值。

1.3 最佳条件下椭偏光蛋白芯片技术检测血清ApoB结果准确性观察 最佳条件下用椭偏光蛋白芯片技术检测0、5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB标准品溶液的灰度值，计算上述ApoB标准品溶液灰度值与不含 ApoB的空白探针溶液(含anti-ApoB和蛋白G)灰度值的差值。对上述ApoB标准品溶液浓度和灰度值差值的相关性进行分析，以ApoB标准品溶液浓度为横坐标，灰度值差值为纵坐标描画标准曲线并用Maple9.5软件建立方程。最佳条件下用椭偏光蛋白芯片技术检测16份40倍稀释的已知ApoB浓度血清的灰度值。将灰度值代入上述方程计算16份血清ApoB浓度，并与其实际ApoB浓度进行比较。本实验共进行2次。

1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。相关性分析采用Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 椭偏光蛋白芯片技术检测ApoB的最优条件 用0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的anti-ApoB和椭偏光蛋白芯片技术检测200 μg/mL的ApoB标准品溶液，所得灰度值分别为67.02、73.81、66.38、66.92、68.44，anti-ApoB浓度为0.3 mg/mL时所得灰度值最大，定为最佳anti-ApoB浓度。

用0.3 mg/mL的anti-ApoB和椭偏光蛋白芯片技术检测5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB标准品溶液，所得灰度值分别为70.69、88.24、87.69、89.22、91.44、94.23。加入0.1 mg/mL的蛋白G后重新测量，所得灰度值分别为106.49、108.12、120.25、133.64、140.77、141.03，均比未加蛋白G时高。蛋白G最佳浓度为0.1 mg/mL。

2.2 最佳条件下椭偏光蛋白芯片技术检测血清ApoB结果准确性 以ApoB浓度为横坐标x、灰度差值为纵坐标y描画标准曲线，Maple9.5软件得出的回归方程为：y=-23.116Ln(1-x/60)，R2=0.936 4。16份血清ApoB浓度和椭偏光蛋白芯片技术测算所得血清ApoB浓度见表1。16份血清apoB浓度和第一次、第二次用椭偏光蛋白芯片技术测算所得血清apoB浓度相比P均>0.05。

表1 16份血清apoB浓度和椭偏光蛋白芯片技术检测所得血清apoB浓度比较(mg/mL)

3 讨论

椭偏光蛋白芯片技术的检测原理是基于生物分子之间(如抗原与抗体、受体与配体、酶与底物等)的高度特异性结合能力。椭偏光成像系统可以检测到0.1 nm厚的分子膜层，因此能够很敏感的检测到反应前后分子膜层厚度变化，从而证实待测液中抗原的存在并计算其浓度。椭偏光蛋白芯片生物学检测技术的优点主要有：①可以同时检测多元样品，既可以同时检测一个样品中的多种蛋白，也可以同时检测含有同一种蛋白的多个样品；②样品无需任何标记和纯化处理，不影响检测物的生物学活性；③样品用量少，采用可以达到次单分子膜层分辨能力的光学技术和蛋白质芯片技术，样品用量仅在10 μL量级；④可以实时检测生物分子的相互作用过程，获得反应速率及反应条件等生物分子反应的动力学参数；⑤检测速度快并且结果直观，检测结果均以数字图像形式输出，可以进行定性和定量检测[1～3]。

芯片表面微格式化是对原本物理化学性质均一的表面进行一定操作，使其带有所需要的格式的过程。蛋白质芯片的表面，经过表面微格式化处理，蛋白质探针就会分布在特定区域。微流道法是光学蛋白质芯片系统常用的表面微格式化方法[4，5]。通过微流道系统，各种蛋白质分子被分别的运送到芯片上的各个单元，并且同时完成固定的过程。如果对芯片上各个探针有着复杂的要求，只需在微流道的点样装置上有顺序添加串并联模块即可。微流道系统不仅能够使各个蛋白质探针之间完全一致还能保证蛋白质探针内部也同样均匀。除此之外，微流道系统大大缩短了芯片的制造时间(以本研究中固定ApoB抗体为例，用微流道方法，固定时间在10 min左右)，减少了样品的用量(本研究中每一样品用量在10 μL以下)；同时由于微流道是可重复使用的，成本也就得到了有效控制。

由于共价键的键能在一般情况下远远超过疏水作用力，其固定效果也必定要超过物理吸附。其中一种可以采用APTES进行改性和再用戊二醛进行醛基化的方法处理的硅片，疏水作用得到了有效的控制，用其固定的蛋白质不仅数量较多，而且活性有显著的提升[6]。本研究采用APTEs改性和再用琥珀酸酐进行羧基化的方法，效果满意。共价固定解决了物理吸附中的蛋白质分子易于被更有活性的蛋白或缓冲液替代而脱吸附的问题，但并不能使蛋白质分子的活性位点定向暴露于硅片外表面，固定到硅片表面蛋白质分子的活性还有进一步提高的可能。用蛋白A对经过疏水化处理的硅片进行表面改性，由于蛋白A能够同多种哺乳动物抗体分子的Fc片段特异性结合，因此，用这种方法进行改性的硅片上的抗体分子，其Fab片段都指向表面外侧，也就是说，其活性部位暴露于表面外侧。这样，在固定数量几乎保持不变的情况下，蛋白质分子的生物学活性有了大幅度的提升，固定的效率有了大幅度的提升[7，8]。由于蛋白A的定向固定作用具有物种选择性，蛋白G的作用更广谱[9]。因此，本研究选择能够结合山羊抗人ApoB抗体的蛋白G作为定向固定蛋白。结果证实同样的实验条件下，装配有蛋白G者测得灰度值要高。

在检测对象确定以后，芯片设计中的一个重要环节就是确立特异性生物学系统，即能够发生特异性结合的分子对或分子组合，如配体与受体、蛋白与蛋白、抗原与抗体、病毒与受体等，并优选配基，以此为基础实现配基和待测生物分子在芯片表面上的特异性复合。按照设计，在芯片上的相应位置进行配基的安装，并保持其原有的生物学活性，形成具有生物学活性的感应表面。

配基的使用，实际上是配基分子上活性位点的利用。蛋白质芯片是由多个表面生物探针组合而成，配基固定于表面上。由于生物分子与芯片基底表面的相互作用，通常会造成生物分子在表面的变形和变性，使生物活性减弱甚至消失。为了充分保持配基在芯片表面上的生物活性，需要设计芯片表面的蛋白质活性装配。一个典型的光学蛋白质芯片是一个组合多种生物活性探针的微小表面，表面积可以从平方毫米到平方厘米量级，视需要而定。无论是配基的装配还是样品的检测，都要在一个生物反应器中进行。分子表面相互作用、分子间相互作用、多面元独立处理和样品检测的串并行、反应条件、结合速率、试剂用量、清洗、均一性等问题将在微小的芯片反应器中得到体现。配基的浓度问题，由于反应单元的表面积是一定的，因此所能结合配基分子的多少就有一定的浓度限制。配基浓度过小，就会造成检测时不饱和反应，而浓度过多就会造成样品的浪费。本研究结果显示检测同一浓度的ApoB，在配基anti-ApoB浓度0.3 mg/mL时灰度值不再增加，也就是说达到饱和吸附，以此确定了最佳anti-ApoB浓度。

正常人血清ApoB浓度基本呈正态分布，浓度范围为600～1 200 mg/L[10]。因此，本研究中结合临床检测范围并考虑样品用量节省问题，确定检测范围为10倍稀释后的标准参考范围，即5～200 μg/mL，检测的灵敏度可达到5 μg/mL。本研究结果表明，标准品ApoB的浓度与测得灰度值和探针灰度值的差值之间具有一定的对应关系，并以ApoB浓度为横坐标x、灰度差值为纵坐标y绘制出标准曲线，确定方程。在对16例健康查体者的血清ApoB进行检测时，根据测得灰度值差值和方程计算出血清ApoB浓度，结果与免疫比浊法所测的浓度值相比差异无统计学意义，说明检测结果准确。以上的实验结果提示我们，椭偏光蛋白芯片系统在检测人血清ApoB蛋白方面具有潜在的临床应用前景。

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Optimization of ellipsometry protein-chip technique in quantitative detection of serum apolipoprotein B

NINGXiang1,WANGJiaojiao,WANGJuan,BIShaojie,SHENGLin

(1TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China)

Objective To optimize the conditions for quantitatively detecting human serum apolipoprotein B via ellipsometry protein-chip technique and to evaluate the accuracy of this technique under optimum conditions.Methods In our study, we detected the gray values of solutions containing 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 and 0.6 mg/mL anti-ApoB and 200 μg/mL ApoB with ellipsometry protein-chip technique, and the optimum concentration was the one with the highest gray value. We detected the gray values of solutions containing 0.3 mg/mL anti-ApoB and 5, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL ApoB before and after protein G was added in those solutions until its final concentration was 0.1 mg/mL. By comparing the grey values, we determined whether protein G should be added or not. We detected the grey values of solutions containing 0, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL ApoB via ellipsometry protein-chip technique under optimum conditions and calculated the difference between them and the gray values of the solutions without ApoB (consisted of anti-ApoB and protein G). Then we analyzed the correlations between the concentrations and the differences by drawing the curve and establishing the equation of it with concentration as X-axis and gray value as Y-axis. At last, we detected the gray values of 16 serum samples diluted 40 times twice through ellipsometry protein-chip technique and immunoturbidimetry under the optimum conditions. Then we calculated the concentrations of ApoB in the samples with the equation and compared them with its practical concentration. Results The optimum concentration of anti-ApoB was 0.3 mg/mL. The gray values in protein G group were higher than that of the contrast group (allP<0.05).The regression equation was y=-23.116Ln(1-x/60),R2=0.936 4 by Maple 9.5 software according to the curve. No significantly statistical difference was found between the ApoB concentrations detected via ellipsometry protein-chip technique and 16 cases of serum apoB concernttations (allP>0.05).Conclusions The optimal conditions for detection of ApoB in serum under ellipsometry protein-chip technique are anti-ApoB with the concentration of 0.3 mg/mL and protein G with the concentration of 0.1 mg/mL. The accuracy of the technique under such conditions is reliable.

ellipsometry protein-chip technique; optical protein-chip; ellipsometry imaging; ApoB; Protein G; Quantitative detection

国家自然科学基金资助项目(81500232)；山东省医药卫生科技发展计划项目(2014WS0155)；山东省自然科学基金-联合专项

资助项目(2014ZRE27456)。

宁翔(1986-)，男，医学硕士，医师主要研究方向为动脉粥样硬化的诊治。E-mail: iningxiang@qq.com

简介：王娟(1980-)，女，医学硕士，主治医师，主要研究方向为动脉粥样硬化的诊治。E-mail: moonlikewang@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.005

R446.11

A

1002-266X(2016)47-0017-04

2016-02-11)