山西猪链球菌2型主要毒力相关基因的克隆及分析

王红宝，李红丽，郭雪丽，韩惠瑛，杨晋青，段亚娜，王志俊，吉 涛

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032；2.山西省动物疫病预防控制中心，太原 030027）

山西猪链球菌2型主要毒力相关基因的克隆及分析

王红宝1，李红丽1，郭雪丽1，韩惠瑛2，杨晋青1，段亚娜1，王志俊1，吉 涛1

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032；2.山西省动物疫病预防控制中心，太原 030027）

为了解37株猪链球菌2型（S.suis 2）山西分离株的毒力基因型及毒力基因变异情况，通过PCR扩增S.suis 2毒力基因GDH、SLY、EPF、MRP，对这4种毒力基因的扩增片段进行测定，并与国内外其他分离株的基因进行比较。结果显示，GDH、SLY、EPF、MRP基因在37株S.suis 2中的检出率分别为86.5%、70.3%、56.8%、62.2%；37个受试菌株毒力基因型主要为GDH+/SLY+/EPF+/MRP+占51.35%，为优势基因型；S.suis 2山西分离株4种毒力基因与国内其他地区S.suis 2分离株的相应基因之间同源性均在99.1%以上，与国外S.suis 2分离株的相应序列同源性在89.9%～100%之间。

山西；猪链球菌；毒力基因；克隆；分析

猪链球菌病是由链球菌引起的猪的一种常见传染性疾病[1-2]。猪链球菌为人畜共患传染病病原，在特定的条件下也可导致人感染发病，特别是猪链球菌2型是一种重要的人畜共患传染病病原，猪链球菌2型感染也是一种人畜共患的急性、热性传染病[3]，世界各国均有发生。链球菌广泛存在于污染的环境中，可以通过消化道、呼吸道及经伤口感染，本病也可由蚊、蝇等昆虫类传播。各类猪只都有易感性，感染后可致猪脑膜炎、败血性肺炎、心内膜炎及关节炎等。在猪群中常见散发或呈地方性流行，对我国养猪业造成巨大经济损失[4]。根据猪链球菌荚膜多糖（Capsular polysaccharide）抗原性的不同，猪链球菌有1～34型和同时含有1型和2型抗原的1/2型，共可分成35个血清型[5-7]，其中猪链球菌2型流行最广，致病力最强[8-9]。致病性强弱与其毒力基因密切相关，毒力基因主要包括荚膜多糖合成酶（capsular polysaccharide biosynthesis,CPS）、谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）、溶血素（suilysin, SLY）、胞外因子（extracellular protein factor,EPF）、溶菌酶释放蛋白（murimidase released protein,MRP）、纤粘连蛋白/纤粘连蛋白结合蛋白（fibroneetin-biningprotein,FBPS）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、毒力相关序列ORF2基因（virulent-associate sequence ORF2）。其中，MRP和EPF已被证明是强毒株的标志；SLY是一种巯基活化类毒素，可能在菌体入侵和裂解细胞过程中发挥作用[10-11]；GDH是一种新近发现的猪链球菌进化上极其保守的种特异性抗原成分，该蛋白抗原是一种极好的诊断抗原，可准确地检测猪链球菌感染。

“山西省猪链球菌病菌株分离鉴定及防治技术研究”项目组于2011—2016年从山西省主要养猪区的养猪场（户）剖解病猪及病死猪，采集相关病变部位的病料，分离鉴定出80株致病菌株，其中有37株属基因2型[12]。本研究于2014—2016年对其中属基因2型的37株进行了主要毒力相关基因的克隆及分析，现将研究情况汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培养条件 山西省猪链球菌病菌株分离鉴定及防治技术研究项目组2011—2016年从山西省主要养猪区的养猪场（户）分离鉴定的37株S.suis 2菌株应用于研究。pMD-18T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。大肠杆菌感受态细胞，由本课题组制备保存。

菌种的初步复苏：将含有7%无菌绵羊血的THB琼脂糖固体培养基于37℃静置培养；菌株增殖：将THB液体培养基，37℃180 r/min摇床培养。

1.1.2工具酶和主要试剂 DL 2 000 DNA Marker、rTaq DNA聚合酶、限制性内切酶BanⅡ、BamH I、Sal I、氨苄西林、无菌绵羊血、Premix TaqTM、基因组提取试剂盒等均购自TaKaRa公司；蛋白酶K购自Merck公司；Todd-Hewitt Broth（THB）为美国BD公司产品。DNA胶回收试剂盒（DNA Gel Extraction Kit）购自北京百泰克生物技术有限公司。脑心浸液培养基、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、十二烷基磺酸钠（SDS）等分别购自TaKaRa、华美生物工程公司等。

1.1.3 主要仪器设备 高速台式冷冻离心机（MIKRO 22R型）为HITTACH公司产品；Ultrospec 2000型紫外分光光度计为Bio-Rad公司产品；PCR仪UNII型、转移电泳槽，购自Biometra公司；Alpha Inotech凝胶成像系统购自美国Bio-RA公司；xw-80A型旋涡混合器购自上海青浦沪西仪器厂；HZS-H型水浴振荡器为哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品；可调式恒温水浴箱购自polystat cc1，HUBER公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆

（1）引物设计。根据文献[13-15]，以GenBank中收录的猪链球菌2型的毒力相关基因序列为参考，经分析后，利用Priner 5.0和Oligo 6.0软件设计GDH、SLY、MRP、EPF的特异性引物，引物均由大连宝生物工程有限公司合成，引物序列见表1。引物合成后，用ddH2O稀释成浓度为10 μmol/L的溶液，-20℃保存备用。

表1 扩增目的基因所需引物

（2）PCR模板的制备。根据文献[16]描述的方法，并做适当改进。将猪链球菌分离株从-70℃冰箱内取出，挑取小块冰晶划线接种于绵羊血平板上培养复苏，挑取单菌落接种于脑心浸液培养基中，37℃恒温水浴过夜培养；取1 mL菌液置于1.5 mL Eppendorf管中，4℃12 000 r/min离心1 min，弃上清液，并将残余液滴吸净；加入200 μL DNA提取液，60℃水浴1 h；然后95℃水浴10 min，冷却至室温，12 000 r/min离心5 min，取上清液保存于-20℃冰箱备用。

（3）毒力基因的PCR扩增。PCR反应采用25 μL反应体系。体系的组成为：10×Buffer 2.5 μL，氯化镁2.5 μL（25 mmol/L），dNTP 2 μL（2.5 mmol/L），上游引物（25 pmol/μL）1 μL，下游引物（25 pmol/μL）1 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，补加ddH2O至25 μL。95℃预变性5 min，经变性、退火、延伸等反复试验，确定各基因最佳循环参数如表2，PCR产物分别用0.8%～1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

表2 目的基因的扩增

（4）基因的克隆与鉴定。采用DNA凝胶回收试剂盒（DNA Gel Extraction Kit）回收纯化扩增片段，按照DNA凝胶回收试剂盒说明进行操作。T载体（30 ng/μL）2 μL，T4连接酶1 μL，回收DNA片段适量并加水补至10 μL，于4℃反应14～16 h，然后转化大肠杆菌感受态细胞。通过蓝白斑筛选含有目的质粒的大肠杆菌菌落，挑取白色菌落扩大培养，碱裂解法提取质粒。对所提质粒进行PCR鉴定和BamH I、Sal I双酶切鉴定。

1.2.2 基因测定与分析 经鉴定为阳性的重组质粒送往大连宝生物工程有限公司进行核苷酸序列测定。为保证测序精确性，每个片段送2个质粒，根据2个质粒测序结果以及与参考毒株序列比较结果确定最终序列。应用分析软件DNAStar对GDH、SLY、EPF和MRP基因序列及其翻译后的氨基酸序列与GenBank中已收录序列进行同源性比较分析。

2 结果与分析

2.1 毒力基因的PCR扩增结果

以猪链球菌山西分离株为模板，用设计合成的引物分别建立扩增单个靶基因的PCR体系。检测结果显示，37株S.suis 2山西分离株，GDH、SLY、EPF、MRP基因检出率分别为86.5%（32/37）、70.3%（26/37）、56.8%（21/37）、62.2%（23/37）；37个受试菌株中GDH+/SLY+/EPF+/MRP+占51.35%（19/37），为优势基因型；各菌株毒力因子具体携带情况详见表3。

表3 猪链球菌2型毒力基因检测

部分试验菌株的毒力基因PCR检测电泳结果如图1—图4。

图1 毒力基因GDH的PCR检测电泳

图2 毒力基因SLY的PCR检测电泳

图3 毒力基因EPF的PCR检测电泳

图4 毒力基因MRP的PCR检测电泳

2.2 毒力基因分析结果

应用分析软件DNAStar对S.suis 2山西分离株的GDH、SLY、EPF和MRP基因及其翻译后的氨基酸序列与GenBank中已收录基因进行同源性比较分析。结果表明，S.suis 2山西分离株4种毒力基因的检测与国内其他地区S.suis 2分离株的相应基因同源性均在99.1%以上，与国外S.suis 2分离株的相应基因同源性在89.9%～100%之间。

2.2.1 同源性分析 将32株S.suis 2山西分离株的GDH基因与国内、国外S.suis 2参考菌株的同源性分别为99.7%～100%、99.1%～100%。19个S.suis 2山西分离菌株的SLY基因部分序列与国内、国外S.suis 2参考菌株的同源性分别为100%和99.1%～100%。19个S.suis 2山西分离菌株的EPF基因部分序列与国内、国外S.suis 2参考菌株的同源性分别为99.6%～100%和89.9%～100%。19个S.suis 2山西分离菌株的MRP基因部分序列与国内、国外S.suis 2参考菌株的同源性分别为99.4%～100%和99.1%～100%。

2.2.2 基因变异分析 对19株S.suis 2山西分离株进行基因变异分析，结果发现，菌株SX-LL2、SXYC1菌株的MRP基因的比对序列中第64—65位存在TA插入突变，菌株SX-LF4的MRP基因的比对序列中第52位由T突变为C。菌株SX-YQ2的MRP基因的比对序列中第52位由T突变为C。GDH、SLY、EPF基因分析未检出变异。

3 讨论

根据已公开发表的相关报道和笔者在长期的工作实践中发现，并不是所有的S.suis 2都具有致病性，纵使有致病性的，其致病性也有强有弱。根据其致病力的不同，从无到有，由弱到强，可将其分为无致病力菌株、弱致病力菌株和强致病力菌株。

国内外目前对猪链球菌致病性研究，主要集中在CPS、GDH、SLY、EPF、MRP、FBPS、GAPDH、ORF2这8种毒力因子上。本研究选择了其中最主要的GDH、SLY、EPF、MRP做为研究对象，是因为MRP和EPF已被证明是强毒株的标志；SLY是一种巯基活化类毒素，可能在菌体入侵和裂解细胞过程中发挥作用[10-11]；GDH是一种新近发现的猪链球菌进化上极其保守的种特异性抗原成分，该蛋白抗原是一种极好的诊断抗原，可准确地检测猪链球菌感染。研究结果发现，山西S.suis 2分离株，GDH基因检出率最高（32/37），其次是 SLY（26/37）、EPF（21/37）和 MRP（23/37）；37个受试菌株中GDH+/SLY+/EPF+/MRP+占51.35%（19/37），为优势基因型。有报道认为猪链球菌2型菌株采集部位，也就是其存在的部位不同，与其不同的毒力因子表型分布有一定的关系，我们将在以后的研究中进一步的研究。

本研究通过对S.suis 2山西分离株主要毒力相关因子的克隆和分析，了解了山西猪链球菌2型的毒力分布情况，对进一步研究和防控猪链球菌病提供了依据。

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（编辑：富春妮）

Cloning and Analysis on the Major Virulence-associated Gene in Shanxi Strain ofStreptococcus SuisSerotype 2

WANG Hongbao1,LI Hongli1,GUO Xueli1,HAN Huiying2,YANG Jinqing1,DUAN Ya'na1,WANG Zhijun1,JI Tao1
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030032, China;2.Animal Disease Prevention and Control Center in Shanxi Province,Taiyuan 030027,China)

To understand 37 strains of Streptococcus suis serotype 2(S.suis 2)from Shanxi isolates of virulence genes and virulence gene variants,by PCR amplification S.suis 2 virulence genes GDH,SLY,EPF,MRP,of the four kinds of virulence gene fragments amplified were determined,and comparing with other isolates genetic at home and abroad.Results show that the GDH,SLY,EPF,MRP gene in 37 strains S.suis 2 detection rate respectively in:86.5%,70.3%,56.8%,62.2%;37 participants strain virulence genes on GDH+/SLY+/EPF+/MRP+is the main advantage of accounted for 51.35%of participants strain genotype;S.suis 2 isolates in Shanxi four virulence genes and other domestic regions S.suis corresponding gene homology between two isolates were over 99.1%,with foreign S.suis 2 isolates the corresponding sequence homology between 89.9%～100%.

Shanxi province;swine Streptococcus suis;virulence genes;cloning;analysis

S858.282.61+1

A

1002-1957(2016)06-0107-04

2016-09-26

山西省农业科学院科技攻关项目（2012ygg35）

王红宝（1968-），男，山西翼城人，副研究员，主要从事动物疫病诊断和防治研究工作.E-mail:sxnkywhb@163.com

郭雪丽，副研究员.E-mail:sxnkygxl1969@163.com