红景天多糖对藏猪精液4℃保存效果的研究

陈晓英，马金英，宋天增，唐建华，赵彦玲，任子利，朱彦宾，王良润

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.西藏自治区畜牧总站，拉萨 850000；3.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；4.西藏牧乐农业科技有限公司，拉萨 850009）

红景天多糖对藏猪精液4℃保存效果的研究

陈晓英1，马金英1，宋天增1，唐建华2，赵彦玲3，任子利3，朱彦宾1，王良润4

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.西藏自治区畜牧总站，拉萨 850000；3.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；4.西藏牧乐农业科技有限公司，拉萨 850009）

试验旨在研究红景天多糖对4℃藏猪精液品质和抗氧化保护作用影响，采用电刺激法采集健康藏猪精液，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加红景天多糖0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃环境保存至第5天，以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价精液品质指标，以超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量为评价抗氧化保护作用指标，探讨红景天多糖对4℃藏猪精液品质影响。结果显示：藏猪精液4℃保存到第5天时，9.0 mg/L红景天多糖添加组的精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率这4个指标均极显著好于其他组（P＜0.01）。7.0 mg/L和11.0 mg/L添加组除精子活力差异显著外，其他指标差异不显著（P＞0.05）。同时发现，9.0 mg/L红景天多糖添加组精子超氧化物歧化酶活力最高，5.0 mg/L、7.0 mg/L和11.0 mg/L组间无差异；精子MDA含量以9.0 mg/L红景天多糖添加组为最高，较7.0 mg/L和11.0 mg/L、5.0 mg/L、3.0 mg/L和对照组差异极显著（P＜0.01），7.0 mg/L和11.0 mg/L添加组无差异。总之，在改进的猪精液稀释液中添加9.0 mg/L的红景天多糖可明显改善4℃环境保存藏猪精液品质和抗氧化保护作用，该试验研究为今后藏猪精液低温保存的生产应用奠定了基础。

红景天多糖；藏猪；4℃环境；精液品质；抗氧化保护

糖类可以提高细胞外的渗透压，使水分透过细胞膜向细胞外流失，引起细胞失水，因为糖类不能透过细胞膜进入细胞[1]。红景天多糖作为传统的中草药提取物，具有镇静[2]、提高免疫力的功能[3-11]，还可以促进三磷酸腺苷（ATP）的合成[12]，调节机体生理能量状态[13]，抗衰老、抗氧化[14-22]。近年来，国内外相继报道了一些糖类作为非渗透性冷冻保护剂对冷冻精子有较好保护作用，以致糖类在精液冷冻乃至低温生物学领域成为研究热点。

猪精液保存技术推广应用的重要性在于通过扩大精液使用的时间和地域范围，提高优秀种公猪的利用效率，从而降低公猪饲养成本，加速猪的遗传改良，避免通过交配传播疾病，同时也在猪品种资源和原始资源及基因库种质资源保存等方面起重要作用。猪精子结构对温度变化特别敏感，猪精液更适合液态保存。公猪精液常温保存在生产上具有较大的实用价值。常温保存人工授精的效果好，且方便经济，但受到保存时间的限制[23-26]，4℃的猪精液保存，温度介于常温和冷冻保存间，精子代谢活动水平低，脂质过氧化程度低，相较于常温保存更久，较冷冻保存则更经济、便利。随着保存时间的延长公猪精液会引发脂质过氧化，超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力下降和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量降低[27-28]，最终引发脂质过氧化，降低线粒体膜电位，提高等离子体膜透性，最终影响受胎率。

随着现代化藏猪养殖生产技术的提高，为有效控制疫病传播、降低饲养公猪的费用、提高猪群品质，解决藏猪精液的妥善保存问题，人工授精技术服务于藏猪产业发展已迫在眉睫。任子利等[29]研究了维生素C对藏猪精液4℃保存及其精子全基因组DNA甲基化的影响，李文烨等[30-38]研究主要集中在利用红景天多糖对猪精液冷冻效果的影响。但是，截至目前，关于红景天多糖对藏猪精液常温或4℃保存效果如何，鲜有报道。本研究拟在此研究的基础上，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加红景天多糖0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃环境保存至第5天，以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价精液品质指标，以SOD活性和MDA含量为评价抗氧化保护作用指标，探讨红景天多糖对4℃藏猪精液品质的影响。以期为藏猪精液低温保存的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与材料

1.1.1 试验动物与试验地点 试验藏猪为3～5岁健康种公猪9头。试验时间为2016年6—9月，试验地点为西藏工布江达县错高乡某藏猪养殖专业合作社、西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所和西藏大学农牧学院动物科学学院。

1.1.2 主要设备与试剂 动物电刺激采精仪（MDW-1，成都华智开物科技有限公司），倒置荧光显微镜（IX73，奥林巴斯），电热恒温水槽（DKB-450A，上海森信），变频冰箱（BCD-649WDVC，海尔），-80℃冰箱（MDF-U33V，合肥荣事达三洋电器股份有限公司）。

考马斯亮蓝（国药集团化学试剂有限公司）、Diff-Quik Stain染液（北京普博斯）、亚卫精液稀释粉（丹麦）、速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣达动物药品有限公司）、SOD试剂盒和MDA测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

新鲜藏猪精液由西藏工布江达县错高乡某藏猪养殖专业合作社提供。

1.2 试验方法

1.2.1 红景天多糖的提取 红景天产自西藏，购于拉萨市场医药销售公司。参照文献[32]将红景天粉碎后置于蒸馏水（80℃）并浸泡5 h，取上清液经旋转蒸发仪浓缩，冻干处理经粉碎获得红景天多糖粉末，密封后置室温保存。

1.2.2 改进的低温稀释液配制 参照孙时军等[39]的试验结果，使用亚卫牌精液稀释剂作为基础稀释剂，在稀释后的精液中加入1%乙二醇作为低温保护剂。

1.2.3 精液采集及处理 采用速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）肌内注射麻醉健康藏猪种公猪，用动物电刺激采精仪于3 V、50 mA条件下电刺激法采集健康藏猪精液。

将藏猪精液（精子活力0.8以上）做4倍稀释，用6层以上纱布包裹后放入培养箱中，17℃平衡2 h后，放入冰箱4℃保存。

1.2.4 精子质量评价 精子活力和精子畸形率两项精液常规性状参照世界卫生组织标准（WHO）[40]的方法测定，具体方法如下。

精子活力：精液过滤后立即在显微镜下观察精子活力，采用百分制法，直线前进精子数占总精子数的百分比为精子活力。

精子畸形率：采用龙胆紫酒精溶液染色法，将精子涂片染色，在400倍显微镜下观察，计算不同视野500个精子中畸形精子占比例即为畸形率（取3次计算的平均值）。

精子顶体完整率和精子质膜完整率两项精液性状参照文献[41]进行评价。精子顶体完整率：考马斯亮蓝R250染色法。精子质膜完整率：低渗肿胀试验—HOST。

1.2.5 精液抗氧化指标的测定 超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的测定，使用SOD试剂盒和MDA测定试剂盒，采用比色法测定精浆和精子中总SOD的活性及MDA含量。具体方法参照文献[42]进行。

1.3 试验设计

1.3.1 红景天多糖对4℃保存藏猪精液品质的影响试验分5组，在改进的猪精液低温稀释液为基础液中，每1 000 mL添加红景天多糖0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g，将藏猪种公猪新鲜精液做4倍稀释后于4℃保存到第5天时以藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率为评价指标，探讨红景天多糖对4℃保存藏猪精液品质的影响。试验重复3次。

1.3.2 红景天多糖对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响 试验分组同1.3.1。每次采精后收集精液，取10 mL鲜精液于玻璃离心管中，在4 000 r/min离心分离15 min，取精浆分装于2 mL塑料离心管，置-80℃冰箱保存备用，用于精浆生化参数及抗氧化指标的测定。试验重复3次。

1.4 数据处理

所得试验数据用Excel进行前期处理，再用SPSS 11.5软件进行One-Way ANOVA方差分析，并进行多重比较，试验结果用平均数±标准差表示，检验误差为5%和1%。

2 结果与分析

2.1 红景天多糖对4℃保存藏猪精液品质的影响

由表1可以看出，藏猪精液4℃保存到第5天时，9.0 mg/L红景天多糖添加组的精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率这4个指标均极显著好于其他组（P＜0.01）。7.0 mg/L与11.0 mg/L添加组除精子活力差异显著外（P＜0.05），其他指标差异不显著。7.0 mg/L和11.0 mg/L添加组与其他添加组的精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率差异均极显著（P＜0.01）；7.0 mg/L与5.0 mg/L添加组精子活力差异显著，但11.0 mg/L与5.0 mg/L添加组精子活力差异不显著。

表1 红景天多糖对4℃保存藏猪精液品质的影响（n=27）

2.2 红景天多糖对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响

由表2可以看出，藏猪精液4℃保存到第5天时，精浆超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量以9.0 mg/L红景天多糖添加组为最高（P＜0.01）；同时发现，9.0 mg/L红景天多糖添加组精子超氧化物歧化酶活力最高，5.0 mg/L、7.0 mg/L和11.0 mg/L组间无差异；精子MDA含量以9.0 mg/L红景天多糖添加组为最高，较7.0 mg/L和11.0 mg/L、5.0 mg/L、3.0 mg/L和对照组差异极显著（P＜0.01），7.0 mg/L和11.0 mg/L添加组无差异。

表2 红景天多糖对4℃保存藏猪精液抗氧化保护作用的影响（n=27）

3 讨论

红景天多糖抑制过氧化反应而提高对藏猪精子的保护效果。红景天多糖具有抗氧化和抗细胞凋亡等多种生物活性[43-45]，且具有较强的清除超氧阴离子自由基（O2-）和抑制脂质过氧化作用的能力[46]，在温度改变过程中抑制过氧化反应对精子的损伤。红景天多糖的添加能有效提高精子内抗氧化酶的活力，对精子起到保护作用。

在4℃保存藏猪精液品质方面，添加红景天多糖的各试验组极显著提高精子活力、精子顶体完整率、质膜完整率，降低了精子畸形率（P＜0.01）；与对照组相比，抗氧化保护方面精液中超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量均具有明显的优势（P＜0.01）。

4 结论

本研究结果表明，在改进的猪精液稀释液中添加9.0 mg/L红景天多糖后将藏猪种公猪精液做4倍稀释，可以明显改善藏猪精液4℃保存的效果，同时可明显提高4℃保存对藏猪精液抗氧化保护作用。本试验研究将为藏猪精液低温保存的生产应用奠定基础。

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（编辑：郭玉翠）

Effect of Rhodiola Polysaccharides on Tibetan Boar Semen Preserved at 4℃and Antioxidative

CHENXiaoying1,MAJinying1,SONGTianzeng1,TANGJianhua2,ZHAOYanling3,RENZili3,ZHUYanbin1,WANGLiangrun4
（1.Institute of Animal Science,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850009, China;2.The Tibet Animal Husbandry Service,Lhasa 850000,China;3.Faculty of Animal Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry College,Nyingchi 860000,China;4.Tibet Mulo Agricultural Sciences and Technology Co.,Ltd.,Lhasa 850009,China）

This study was conducted to investigate the effects of Rhodiola Polysaccharides on Tibetan boar semen preserved at 4℃and antioxidative.The semen was collected from Tibetan boar by electrical stimulation.Add Rhodiola Polysaccharides 0 g,3.0 g,5.0 g,7.0 g,9.0 g,11.0 g per 1 000 mL,in the improvement of pig semen low temperature dilution liquid.Save to fifth days at 4℃after dilution of fresh semen.Body integrity and membrane integrity rate of the top Tibetan pig sperm activity,sperm abnormal rate and semen quality evaluation index,to investigate the effect of Rhodiola Polysaccharides on the quality of semen quality at 4℃,the activity of Superoxidas dismutase（SOD）and Maleic dialdehyde（MDA）were the indexes to evaluate the protective effect of antioxidation.The results show that,to the fifth days，Tibetan boar semen preserved at 4℃,sperm motility,sperm abnormality rate,sperm integrity rate and plasma membrane integrity rate with add group of Polysaccharide 9.0 mg/L from root of the root,these 4 indicators were significantly better than other groups（P＜0.01）.The sperm motility was significantly（P＜0.05）different between the 7.0 mg/L and 11.0 mg/L text groups,other indicators were not significant.Also,at the same time,we found that,addition of Polysaccharides from semen of low temperaturedilution liquid of Tibetan boar semen,9.0 mg/L Rhodiola Polysaccharides supplementation group sperm superoxide dismutase (SOD)activity is the highest,but there was no difference between 5 mg/L,7 mg/L and 11 mg/L groups.9.0 mg/L Rhodiola Polysaccharides supplementation group sperm MDA activity is the highest,compared with 7 mg/L and 11 mg/L,5 mg/L,3 mg/L and control group,the difference was very significant（P＜0.01）,7 mg/L and 11 mg/L add group no difference.In short adding 9.0 mg/L Rhodiola Polysaccharides to the improved pig semen diluent can significantly improve the semen quality and antioxidant protection at 4℃.The experimental study laid a foundation for the production and application of cryopreservation of boar semen in the future.

RhodiolaPolysaccharides;Tibetanpig;environmentalscienceat4℃;semenquality;antioxidantprotection

S816.7

A

1002-1957(2016)06-0033-04

2016-10-31

西藏自治区自然科学基金（2016ZR-15-37）；西藏自治区2016年高校青年教师创新支持计划项目（NO.QCZ2016-47）；西藏自治区2016年农林业科技成果转化与推广（农牧业技术推广）项目“特色畜禽（藏猪）营养调控研究”

陈晓英（1981-），女，甘肃武威人，助理研究员，硕士，主要从事高原畜禽繁殖技术研究工作.E-mail：chenxiaoying0891＠163.com

宋天增（1980-），男，助理研究员，硕士，研究方向为动物繁殖营养调控与遗传育种.E-mail：songtianzeng123＠sina.com