6株鹅细小病毒的分离及其VP3基因序列分析

周彩显，吴昊，于晶，阳丽媛，姚望远，赵健，伊淑帅，董浩，胡桂学

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

6株鹅细小病毒的分离及其VP3基因序列分析

周彩显，吴昊，于晶，阳丽媛，姚望远，赵健，伊淑帅，董浩，胡桂学*

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

为了解吉林省不同地区小鹅瘟流行情况，从吉林省磐石、白城、九台、德惠、辽源与镇赉地区鹅养殖场采集疑似小鹅瘟雏鹅的肠管，处理后接种SPF鹅胚成功分离到6株病毒(暂命名为PSH、BCH、JLJT、DH、LY与ZL株)，经PCR鉴定为鹅细小病毒。VP3基因序列分析结果显示，分离到的6株鹅细小病毒VP3基因与近年来国内流行毒株同源性较高，核苷酸与氨基酸同源性分别为93.1%～99.6%与95.9%～99.4%。其中，BCH株、JLJT株与LY株属同一分支，与浙江和扬州等地区分离的鹅细小病毒相似性较高，达到99.4%～99.6%；ZL株、DH株与PSH株属同一分支，相似性较低。试验表明，吉林省流行的鹅细小病毒与我国南方地区流行毒株同源性较高，与其他地区流行毒株存在一定差异。

鹅细小病毒；分离；VP3基因

鹅细小病毒病又称小鹅瘟，是一种由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的以雏鹅和雏番鸭出血性、败血性纤维素性肠炎为主要特征的急性或亚急性高度接触性传染病，具有传播速度快与死亡率高等特点，对鹅养殖业造成了严重威胁[1-2]。自1956年，我国学者方定一发现小鹅瘟后，该病相继在各个地区均有报道。20世纪80年代以后，在国内几乎每个地区具有该病的出现，对鹅养殖业带来了严重的经济损失[3-4]。吉林省作为我国鹅养殖大省，小鹅瘟的流行成为制约养鹅业发展的主要因素。近年来，吉林省磐石、德惠、九台与镇赉地区大型鹅养殖场相继暴发小鹅瘟疫情，对养殖业造成了严重的经济损失。因此，了解吉林省不同地区小鹅瘟的流行情况，对小鹅瘟的防治意义重大。本试验通过尿囊腔接种鹅胚从吉林省不同地区小鹅瘟疑似病料种分离到6株病毒，经PCR初步鉴定为鹅细小病毒。对分离株的VP3基因进行序列测定与分析，并与近年来国内流行毒株进行同源性分析，以期为指导本地小鹅瘟的防治工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 GPV标准毒株B株由吉林省畜牧兽医科学研究院惠赠；Viral DNA Extraction kit，DNA Gel Extraction kit，Plasmid Mini Preparation kit购自OMEGA公司；Ex Taq酶、dNTP、10×buffer、DL 2000 maker、pMD-18T质粒、DH5α感受态等均购自大连宝生物公司。MikRo 22R高速冷冻离心机(德国HETTICH公司)、MCO-18AIC 恒温孵化箱(日本SANYO公司)、TC-25/H PCR仪(BIOER公司)、DYY-6B电泳仪凝胶成像系统(BIO-RAD公司)等。

1.2 病料来源及处理 疑似小鹅瘟雏鹅的肠管采集自吉林省九台、磐石、白城、镇赉、辽源、德惠地区鹅养殖场的发病鹅群。采集的病料使用含1%双抗溶液的生理盐水进行组织匀浆，反复冻融3次后，10000 r/min离心10 min，收集上清液，经0.22 μm纤维滤膜过滤后保存备用。

1.3 病毒分离 10日龄鹅胚由吉林农业大学鹅养殖中心提供，按照0.2 mL/胚的剂量分别将6个地区处理过的病料组织匀浆液经尿囊腔接种鹅胚，接种后每隔12 h观察鹅胚的存活状态，连续观察5 d，无菌收集24 h～120 h内死亡鹅胚的尿囊液与-80 ℃保存，并按照上述方法连续盲传5代，收集尿囊液并保存。

1.4 病毒鉴定 使用Viral DNA Extraction kit提取盲传第5代尿囊液中病毒的DNA，以病毒DNA为模板，去离子水、GPV标准株B株DNA为阴、阳对照，采用胡桂学等[5]建立的GPV检测体系及条件进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5 VP3基因的扩增及序列分析 以提取的盲传第5代尿囊液病毒DNA为模板，根据本实验室设计的VP3扩增引物[6]扩增分离株VP3基因片段，预期片段大小为1605 bp。扩增条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃终延伸10 min，共30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，经胶回收后连接pMD-18T载体，转化DH5α感受态大肠杆菌，挑取阳性菌落提取质粒分别命名为T-JLJT-VP3、T-PSH-VP3、T-BCH-VP3、T-ZL-VP3、T-LY-VP3与T-DH-VP3，并送往上海生工有限公司测序。

将测序结果进行拼接构成完整的VP3基因序列，查找近年来于GenBank上发表的GPV VP3基因序列，使用MegAlign软件进行基因序列及氨基酸序列同源性分析并绘制进化树。

2 结果

2.1 病毒分离及传代 采集自吉林省磐石、镇赉、白城、九台、 德惠、辽源地区的疑似小鹅瘟病料经处理后接种10日龄鹅胚，72 h～120 h内鹅胚全部死亡，尿囊液连续盲传5代仍能致死鹅胚，证明成功分离到6株病毒，暂命名为磐石株(PSH)、镇赉株(ZL)、白城株(BCH)、九台株(JLJT)、德惠株(DH)与辽源株(LY)。

2.2 病毒PCR鉴定结果 利用GPV 鉴定引物GPV F/GPV R，对提取的盲传第5代尿囊液病毒DNA进行特异性扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测得到特异性目的条带，与预期结果一致，片段大小约为375 bp(图1)。经序列测定以及在线Blast比对，与GPV同源性为95.7%～99.6%，初步确定分离到的6株病毒均为GPV。

M：DL 2000Maker；1～6：JLJT、PSH、BCH、ZL、LY、DH；7：阳性对照(GPV标准株B株)；8：阴性对照图1 病毒PCR鉴定结果

2.3 VP3基因扩增结果 以6株病毒盲传第5代尿囊液提取的DNA为模板，本实验室设计的VP3扩增引物VP3 F/VP3 R对6株病毒的VP3基因进行特异性扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳得到特异性目的条带，结果如图2所示。6株病毒均在1605 bp左右出现目的条带，与预期结果一致。

2.4 VP3基因序列测定及遗传进化分析 将6株病毒的阳性克隆质粒送往上海生工生物工程公司测序，测序结果经拼接后均为1605 bp。根据近年来GenBank上发表的GPV VP3基因序列，应用MegAlign软件分析6株GPV分离株JLJT、PSH、BCH、ZL、LY、DH与已发表GPV毒株的同源性，并绘制系统进化树(图3)。

M：DL 2000Maker；1～6：JLJT、PSH、BCH、ZL、LY、DH图2 病毒VP3基因扩增结果

▲代表6株GPV分离株VP3基因图3 GPV分离株VP3基因核苷酸系统进化树分析

遗传进化分析结果表明，6株GPV分离株VP3基因与近年来国内流行的GPV以及GPV标准毒株B株VP3基因同源性均在93.1%～99.6%之间。其中，BCH株、JLJT株、LY株属同一分支，JLJT株与LY株相似性最高，达到99.4%，JLJT株与2013年扬州分离株YZGY同源性高达99.6%，BCH株与2013年浙江分离株ZJXF同源性达到99.4%。ZL株、DH株、PSH株属同一分支，3株病毒相互之间同源关系较远，但是PSH株与2007年广东分离株GZGD同源性较高，达到99.6%。2.5 VP3基因推导氨基酸序列分析 根据6株GPV分离株VP3基因序列推导VP3氨基酸序列，VP3基因序列为1605 bp，编码534个氨基酸。应用MegAlign软件对推导出的氨基酸序列进行遗传进化分析，并绘制系统进化树(图4)。结果表明，6株GPV分离株VP3基因推导出的氨基酸序列与其余11株GPV VP3基因氨基酸序列同源性介于95.9%～99.4%之间，其中，BCH株、JLJT株、LY株与扬州分离株YZGY属于同一分支，JLJT株与YZGY株同源性最高，达到99.4%；PSH株与广东分离株GZGD属于同一分支，同源性为98.7%，DH株、ZL株与其余毒株同源性较远，但也达到95.9%～98.3%。

▲代表6株GPV分离株VP3基因推导氨基酸序列图4 GPV分离株VP3基因推导氨基酸序列系统进化树分析

3 讨论

GPV主要侵害1～20日龄的易感雏鹅与雏番鸭，引起雏鹅与雏番鸭感染发病，具有发病快、发病率高与死亡率高的特点。GPV感染后2～5 d就可以波及整个鹅群，造成雏鹅大批量死亡，对鹅养殖业造成了严重的威胁[7]。因此，GPV毒株的分离成为研究GPV遗传进化特点、生物学特性及疫苗研发的重点。目前，使用鹅胚或鹅胚成纤维细胞进行GPV的分离是最为普遍的方法。王建等通过鹅胚接种成功分离到4株GPV，并将分离株接种鸡胚，鸡胚未发生病变[8]；邱娜等使用不同代次的鹅胚成纤维细胞连续培养YN株GPV，获得了高滴度的鹅细小病毒细胞适应株[9]。本试验通过尿囊腔接种鹅胚成功分离到6株病毒，通过PCR验证所分离的病毒均为GPV，并暂命名为PSH株、ZL株、BCH株、JLJT株、DH株、LY株。此外，通过连续盲传的方法，获得了稳定的GPV毒株。

鹅细小病毒结构蛋白VP3基因具有相对较高的保守性，同时可以诱导机体产生中和抗体，是GPV的保护性抗原，常作为GPV分子生物学诊断以及遗传进化分析的依据[10-11]。胡桂学[5]、布日额[12]、Limn[13]、赵妍[14]等许多学者均针对GPV的VP3基因建立了小鹅瘟PCR检测方法，且均有很好的特异性及敏感度。其中，布日额、Limn建立的PCR检测方法是根据GPV的VP1与VP3基因设计的扩增引物，检测准确率高，但检测过程较为繁琐；赵妍建立的检测方法为二重PCR，可以同时检测鸭瘟病毒与番鸭细小病毒，不适于检测鹅源细小病毒；胡桂学建立的小鹅瘟PCR检测方法特异性与敏感性均较高，并在吉林地区鹅细小病毒流行病学调查中得到了充分的验证[15]。因此，本试验采用胡桂学建立的GPV PCR检测方法对6株病毒分离株进行了PCR检测，结果均在375 bp左右出现了目的条带，与预期结果一致。通过序列测定及在线Blast比对，与GPV同源性为95.7%～99.6%，确定分离到的6株病毒均为GPV。

根据VP3基因及所对应的氨基酸序列进行进化分析，分析毒株间亲缘关系，也可以对不同毒株引起的疫病流行情况进行系统的分析。本试验通过对6株GPV分离株VP3基因与国内近年来流行的GPV毒株以及GPV标准毒株B株同源性比较，结果核苷酸与氨基酸同源性均较高，分别为93.1%～99.6%，95.9%～99.4%。其中，BCH株、JLJT株、LY株属同一分支， 与2013年扬州分离株YZGY的核苷酸同源性较高。ZL株、DH株、PSH株属同一分支，3株病毒相互之间同源关系较远，但是PSH株与2007年广东分离株GZGD同源性较高。PSH株与广东分离株GZGD株，BCH株、JLJT株、LY株与扬州分离株YZGY为同一株病毒，是南方GPV毒株在传播过程中的变异毒株。造成这一现象的原因可能是由于近年来吉林省鹅养殖规模不断扩大，由南方地区引入的种鹅数量也随之增多，从而导致南方鹅群携带的GPV毒株进入吉林省并发生变异造成大规模流行。通过本试验对吉林省不同地区的GPV毒株流行情况进行了调查，并证明分离到的6株GPV毒株与近年来我国南方流行毒株同源性较近，推测为南方GPV毒株的变异毒株，可为吉林省不同地区鹅细小病毒的研究与防治提供依据。

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(编辑：李文平)

Isolation of 6 Strains of Goose Parvovirus and Analysis of VP3 Gene

ZHOU Cai-xian, WU Hao, YU Jing, YANG Li-yuan, YAO Wang-yuan,ZHAO Jian，YI Shu-shuai, DONG Hao, HU Gui-xue*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to evaluate the epodemic development of goose parvovirus (GPV) in different district of Jilin province, intestines of suspected goose were collected from poultry farm in different regions including Panshi, Baicheng, Jiutai, Dehui, Liaoyuan and Zhenlai city of Jilin province, and 6 strains named respectively PSH, BCH, JLJT, DH, LY and ZL, were isolated with inoculating SPF goose embryos. The detection of PCR showed that all six samples were positive for goose parvovirus. The result of sequence analysis of VP3 gene showed that the 6 isolated strains shared high identities with the domestic popular strains in recent years, with 93.1%～99.6% and 95.9%～99.4% homology. Among them, BCH, JLJT and LY located in the same branch, all three strains had a high homology at 99.4%～99.6% with isolayed strains from Zhejiang and Yangzhou; ZL, DH and PSH located in the same branch, but the homology was low. This assay indicate that the epidemic GPV strain in Jilin province possessed high identities with epidemic strain of the southern China, and different from strains in other areas.

goose parvovirus; isolation; VP3 gene

吉林农业大学国家级大学生创新创业训练计划项目(201410193016)；吉林省科技发展计划项目(20130522086JH)

周彩显，从事动物病原学研究。

胡桂学。E-mail：huguixue901103@163.com

2016-01-02

A

1002-1280 (2016) 03-0001-05

S854.4+3