miRNAs与丙型肝炎病毒感染的相关研究进展

张沛欣 梁彦 贾战生 张颖



·综 述·

miRNAs与丙型肝炎病毒感染的相关研究进展

张沛欣 梁彦 贾战生 张颖

丙型肝炎病毒(HCV)是一种嗜肝的，有包膜的单股正链RNA病毒，归属于黄病毒科[1]。HCV基因组包含了5’和3’非翻译区，这两个非翻译区对病毒的复制和翻译起到了重要的作用。HCV基因组的5’非编码区(non-coding region, NCR)中包含一个内核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)，可与40S核糖体亚单位有效结合，成为病毒翻译的起始位点，帮助病毒基因组合成一个约为3 010个氨基酸的多蛋白前体，这个氨基酸前体接下来被病毒以及宿主细胞中的酶酶解成3个结构蛋白和7个非结构蛋白。3个结构蛋白是核心蛋白(core蛋白)和两个糖蛋白(E1和E2)，7个非结构蛋白是p7、NS2、 NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。核心蛋白形成的衣壳被含有糖蛋白E1和E2的脂质双分子层包裹[2]。这些病毒蛋白单独或者与宿主细胞因子相互作用调节各种不同的信号通路，以有利于病毒持续感染[3]。

1993年人类首次发现miRNAs，到目前为止，人miRNA家族已有2 588个成熟miRNA。预测这些miRNA可以靶向60%的mRNA。这些miRNAs约占人类总基因组的1%。miRNA是一类保守的非编码RNAs，大约18～22个核苷酸，在调控基因表达中起到了重要作用。miRNA由RNA聚合酶II转录，形成初级miRNA，初级miRNA由核酸酶Drosha酶切后形成miRNA前体，最终由核酸酶Dicer形成成熟的单链miRNAs。单链miRNAs一旦合成后，会与两个蛋白家族GW182 和 Argonaute/EIF2C (AGO)形成miRNA诱导的沉默复合物，调节miRNAs与mRNA靶向识别[4]。

很多miRNAs基因位于染色体中经常发生改变的区域，比如说在肿瘤发生过程中，这一区域会出现基因缺失或者基因扩增的现象，从而造成miRNAs表达的改变[5]。近年来，研究同样发现病毒与宿主相互作用涉及到的一些调控过程影响着胞内miRNAs表达谱变化。胞内miRNAs还可以调控蛋白的表达水平，从而影响病毒的趋向性与嗜性，可能影响病毒的感染性，也可能在抗病毒免疫应答中起到了关键的作用。很多RNA病毒可以参与降解、促进或是抑制胞内miRNAs，使其更有利于病毒的生命周期[6]。研究发现，一方面HCV感染影响着胞内miRNAs的表达，另一方面一些胞内miRNAs通过直接靶向病毒基因组或是间接靶向宿主的基因影响病毒的的复制[7]。

一、胞内miRNAs与HCV基因组直接相互作用

越来越多的研究发现多种miRNAs 在HCV感染过程中参与了病毒复制。这些miRNAs可以直接靶向HCV基因组，参与调控。Jopling等[8]发现在HCV感染过程中,下调内源性miR-122的水平显著降低了HCV的RNA丰度，首次证明了miR-122在HCV感染过程中起作用。miR-122直接与病毒5’UTR区的两个相邻位点结合，形成一个低聚物复合体，防止病毒基因组5’末端被核酸酶分解，因此稳定了病毒RNA结构，促进了病毒的增殖。最近还发现，miR-122通过靶向5’端核酸外切酶Xrn1来保护HCV的RNA[9]。除了这两个靶点外，HCV基因组还有其他两个mir-122靶点，分别在3’UTR区的可变区和NS5B的编码区。但是mir-122与这两个位点结合，并不利于HCV复制和翻译。除了mir-122外，mir-448、mir-196、mir-199a、mir-let-7b(见表1)和mir-181c也可以直接作用于HCV基因组，这些miRNAs与HCV相互作用，影响HCV的复制[10]。过表达mir-448和mir-196，分别靶向HCV基因组的core编码区和NS5A编码区，持续减弱HCV复制能力[11]。mir-199a可以与HCV基因型为1b或2a的5’UTR区的第二个颈环结构结合，抑制HCV复制。突变分析发现let-7b可以和不同HCV基因型的5’UTR区以及NS5B编码区结合从而保护病毒基因组。Mukherjee等[12]发现 mir-181c结合到HCV E1和NS5A上，同样可以降低病毒复制，但是其与HCV基因型1a和2a的结合效率有所不同。这说明miRNAs的表达或者与靶基因的结合效率不同可能与病毒基因型有关，因此在未来的研究中，需要了解不同基因型的HCV与miRNAs的相关性。

表1 直接靶向HCV基因组的miRNA

二、胞内miRNAs通过靶向干扰素信号通路调控HCV复制

内源性I型干扰素(IFN)是主要的抗病毒细胞因子。IFN-a /IFN-β和受体结合后产生的信号，通过Jak-STAT通路激活几百个干扰素刺激基因(ISG)[13]。然而，丙肝病毒已经具备了多种策略来逃避干扰素信号通路，促进病毒的复制。如HCV可以通过诱导miRNA靶向参与病毒感染过程中与固有免疫相关的基因，来逃避I型干扰素通路的抗病毒作用。研究发现多种miRNA靶向ISG，协助病毒复制。HCV患者肝活检组织以及体外HCV感染的肝细胞中都发现mir-130a表达上调，它可以通过靶向IFITM1来逃避IFN的应答。敲除mir-130a或是经过IFN治疗后，IFITM1在HCV感染患者中积累，与HCV受体CD81、occludin相互作用，干扰病毒入胞过程，并且miR-130a的表达水平与TGF-β信号通路有相关性， IFN治疗后，miR-130a表达水平明显降低[14-15]。miR-21、mir-758、miR-122的上调也可以干扰素产生。Chen等[16]发现上调miR-21抑制了 MyD88和IRAK1在HCV感染的肝细胞中的表达，从而抑制了I型干扰素效应基因的表达，削弱了I型IFN介导的抗病毒效应，促进病毒复制。在另一项研究中，丙肝病毒感染者mir-758表达上调，与TLR3和TLR7 的表达水平呈负相关， IFNα和IFNβ的表达因此降低，固有免疫应答水平减弱[17]。mir-122除了在HCV基因组复制中，起重要的作用，还有研究发现，过表达miR-122还可干扰了IFN信号通路，沉默miR-122通过降低SOCS3的表达，增强IFN诱导的ISRE的活性，这也是miR-122的反义寡核苷酸抑制HCV复制的另一个机制[18]。mir-221通过靶向SOCS1和SOCS3，保护了JAK/STAT信号，增强了IFN-α的抗丙肝病毒效应更有效的抑制了HCV的复制[19]。

三、胞内microrna参与慢性HCV感染的干扰素治疗

microrna在宿主抗丙肝病毒感染的治疗过程中有深远的影响。研究发现，经过干扰素和利巴韦林治疗后，主要有九个miRNAs差异表达，上调的miRNAs有miR-27b、miR-122、miR-378和miR-422b；下调的miRNAs有miR-18a、miR-34b、miR-143、miR-145和miR-652[20]。其中mir-122参与IFN治疗的早期应答。与对IFN治疗无应答的患者相比，对治疗有应答的丙肝患者mir-122水平显著升高。mir-122与IFN-λ3的多态性以及IFN治疗效果有关。HCV感染的病人IFN-λ3若为CC型，治疗效果好，mir-122的表达水平也有升高，在PEG-IFN/RBV 治疗过程早期，IFN-λ3基因型为CC的患者与IFN-λ3基因型为CT/TT基因型相比，HCV病毒载量迅速下降[21]。这就说明了mir-122可能在早期病毒载量下降中发挥重要作用，并且可能参与固有免疫应答。Adelle P McFarland等人发现mir-208b和mir-499a-5p表达水平在HCV患者中高表达，引起IFN-λ3下调，抑制mir-208b和mir-499a-5p有可能作为一种辅助治疗方法，来提高IFN-α和RBV应答率[22]。与HCV治疗后病毒阴性患者相比，慢丙肝初治患者外周血淋巴细胞中miR-155表达水平明显上升，并且miR-155的表达水平与病毒载量正相关，这可能也与IFN应答有关[23]。

四、miRNAs与HCV感染相关性肝脏疾病

HCV通过调节miRNAs的表达水平，来调控关键的基因表达水平，而这些基因的表达可能与病毒载量、病毒清除以及与丙型肝炎相关的疾病发生发展有关。最近通过研究急性感染HCV的黑猩猩肝细胞和血清中miR-122与病毒复制的动力学。发现在急性感染期，miR-122的表达呈上升趋势，说明miR-122在病毒复制中起重要作用。但是在急性期以后的10-14周，肝脏与血清中miR-122水平与HCV载量水平却呈负相关[24]。在HCV清除和谷丙转氨酶恢复正常时，肝脏中miR-122的表达水平又呈上升趋势。因此总的来说，在HCV感染后miR-122的表达与HCV载量呈先上升后下降再上升的趋势。异常的miR-122表达还在细胞周期的G0和G1阶段促进了内部核糖体进入位点依赖的HCV 翻译。酒精调节miR-122和cycling G1的表达增强了病毒的复制，miR-122抑制剂的使用降低了酒精引起的HCV载量和蛋白的表达水平[25]。另外，引用酒精引起的miR-122上调是通过增加GW182和热激活蛋白90来促进HCV复制的。但是过表达的miR-122可以通过下调occludin来缓解HCV入胞。由此可见miR-122对HCV的调控是多方面的[26]。除了直接靶向病毒基因组的miR-122，miR-196a通过间接靶向抗氧化抑制剂Bach1和抗炎因子血红素氧化酶(HMOX1)来抑制HCV RNA以及NS5A蛋白表达。另外，在HCV感染者中，高表达的HMOX1和高表达的Bach1、miR-122正相关[27]。一些miRNA的分析研究证明在HCV感染中，多种miRNAs表达水平发生改变并且存在miRNA-mRNA调控网络。与正常对照细胞相比，转染Con1(HCV1b型)的细胞中hsa-miR-130a、 hsa-miR-130b、 hsa-miR-298、hsa-miR-193a-5p和hsa-miR-371-5p 都有不同程度的上调。这些miRNAs在感染HCV的细胞中，通过靶向PPARG、IRF1和STAT3来影响细胞生长。除此之外miR-24, miR-149, miR-638 and miR-1181的 差异表达同样被鉴定到，这些差异表达的miRNAs与HCV入胞、复制和增殖有关[28]。

HCV慢性感染与肝脏炎症、纤维化、脂肪肝、肝硬化和肝细胞癌密切相关。多种miRNA参与了这一过程。Marquez等[29]研究发现在感染HCV的患者组织和四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中，miR-21的表达水平显著升高，并与肝纤维化程度正相关。miR-21可靶向TGF-β的负调控信号SMAD7，诱发肝纤维化发生。Bandyopadhyay等[30]研究发现在HCV感染者肝脏中miR-29低表达，过表达miR-29可以抑制感染HCV肝细胞中的病毒载量，相反抑制miR-29可以活化肝星状细胞和胶原蛋白合成。Ramachandran等[31]研究发现，mir-200c的高表达也与肝纤维化有关。miR-200c降低Fas相关磷酸酯酶-1的表达，随后激活Src激酶信号，增加胶原蛋白和纤维母细胞生长因子的表达参与纤维化。miR-449a和miR-107也在慢丙肝中表达降低，在HCV感染过程中，miR-449a通过靶向NOTCH信号调节YKL40的表达。慢性丙肝患者中高表达的YKL40可促进细胞外基质的合成和纤维化。在HCV相关肝脏疾病中，miR-449a和miR-107还通过靶向IL-6R复合体调控趋化因子CCL2的表达。miR-449a和miR-107分别靶向IL-6R和JAK1来抑制IL-6信号和STAT3的激活[32]。上述研究表明，在慢性HCV感染中，miRNAs与靶基因相互作用参与了肝脏的炎症和纤维化过程。

慢性HCV感染引发的另一个重要的疾病就是肝细胞癌。microrna的失调与肝细胞癌的发生和发展有关。检测与肝细胞癌相关的miRNAs的表达水平，可能有利于肝细胞癌的早期诊断。HCV通过靶向不同的信号通路调控miRNAs的表达，使肝细胞的生长向着有利于肿瘤的方向发展。miR-155的表达水平在HCV患者中显著升高，过表达的miR-155通过激活β-链蛋白促进细胞增值，之后细胞周期蛋白D1、原癌基因和存活素的表达也随之上调，miR-155还可以降低APC的表达，激活Wnt信号通路，促进肝细胞增值与肿瘤发生[33]。Varnholt等[34]研究了52个石蜡包埋的样本，包括43个肝细胞癌样本和9个癌变前的发育异常的结节，相比健康志愿者有10个上调的miRNA和19个下调的miRNA。其中mir - 122在发育异常恶性肝脏结节中表达上调，它可能通过下调肿瘤抑制基因，从而导致肿瘤的生长。Xu等[35]发现HCV-core上调了miR-196a的表达，参与HCV-HCC细胞异常增值，过表达的miR-196a在HepG2、Huh7等肝细胞癌细胞系，通过调控G1/S过渡期影响细胞复制。

五、小结

越来越多证据表明，miRNA 的异常表达在丙型肝炎发病机制中可能具有重要作用，在丙型肝炎疾病发生发展的不同阶段，存在不同的miRNA异常表达。本文通过阐述不同的HCV复制状态以及不同阶段， miRNA 表达的特点及其调控机制，为慢性丙型肝炎的发病机制以及新的治疗手段提供支持。但是miRNAs作为治疗丙肝药物单独或结合目前氖和药物来治疗丙肝病毒感染的病人仍处于初步阶段。还需要进一步的深入研究来了解microrna调制的丙肝病毒感染的机制。

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(本文编辑：张苗)

国家自然科学基金面上项目(81270499)

710038 陕西西安 第四军医大学唐都医院传染科

张颖，Email：zyfmmu@hotmail.com

2016-09-05)