杂多蓝负载的壳聚糖纳米粒子抗菌性能研究

王 杰, 严玉萍, 杨 红, 杨仕平

(上海师范大学 生命与环境科学学院,上海 200234)

杂多蓝负载的壳聚糖纳米粒子抗菌性能研究

王 杰, 严玉萍, 杨 红, 杨仕平

(上海师范大学 生命与环境科学学院,上海 200234)

杂多蓝作为多酸衍生物,由于其独特的物理、化学性质,近年来受到人们越来越多的关注,在抗菌方面已有一些研究进展.壳聚糖广泛的来源和低廉的价格等优点也使其成为目前为止运用最广的抗菌剂种类之一,但壳聚糖本身的抗菌性很低,只能对特定的细菌产生抑菌效果.主要利用壳聚糖上氨基能与带负电荷的杂多蓝通过静电作用有效结合,采用一步法合成了基于近红外光热辅助抗菌的杂多蓝/壳聚糖(HPB/CS)纳米粒子,该纳米粒子在溶液中具有较好的光热转换效果和抗菌效果,并且在808 nm激光辅助下有利于增强抗菌效果.

杂多蓝; 壳聚糖; 纳米粒子; 光热转换; 抗菌

0 前 言

在人们的日常生活中,经常会接触到很多种细菌,其中比较常见的有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌等.细菌的种类繁多,适应能力较强,其中有不会对人类造成危害甚至有益的细菌,如酵母菌等.但也有可以使人患病或导致人死亡的,比如霍乱、肺炎、结核病、肝炎和疟疾等细菌,会给人们的身体健康构成严重的威胁.由微生物病菌引起的疾病往往很严重,有时是因为人们对其菌原体认识不清,造成误诊错诊,直至导致患者死亡.为了尽量减少和阻止有害微生物病菌给人们的健康和生活带来危害,人们制备抗菌剂或抗菌材料,通过破坏细菌的新陈代谢系统来杀灭或抑制其生长繁殖.

随着人们对生活质量要求不断提高,各种抗菌药物应运而生.然而,革兰氏阳性球菌感染不减反增,耐甲氧西林金黄葡萄球菌检出率上升,耐青霉素肺炎链球菌在许多国家与地区传播,耐糖肽和其他多种抗生素的耐万古霉素肠球菌也出现了.为了有效地控制细菌,尤其是耐药菌感染,研究开发新型抗菌药物很有必要.在众多的抗菌材料研究中,杂多蓝(Heteropoly Blue,HPB)也是其中研究热点之一.杂多蓝是杂多酸及其盐还原后得到的混合价态配合物,结构的畸变与特殊的性质使其具有独特的性能,具有比母体酸(或盐)更优异的抗碱解能力,对氧化还原、热和酸碱有更好的稳定性,在抗病毒、抗癌和抗菌方面都有良好的效果.大量新型的杂多蓝不断被报道出来,比较有代表性的有钒帽杂多蓝[1-4],经典的 Keggin 型结构杂多蓝[5-8]和一些其他结构新颖的杂多蓝[9-13].其中,Keggin结构钨系杂多化合物毒性较低且具有抗艾滋病毒(HIV-l)活性[14],在抗菌研究中逐渐显示出重要的应用前景.本文作者所选用的杂多蓝就是Keiggn型杂多蓝[(CH3)4N]5[α-PMo2W10O40].

纳米材料由于具有小尺寸效应、介电限域效应、量子隧道效应、表面效应等而被广泛应用于生物荧光标记、靶向药物载体、生物探针、催化剂、抗菌和生物传感等方面[15-19].壳聚糖是目前为止运用较广的抗菌剂种类之一,然而其本身的抗菌性很低,只能对特定的细菌产生抑菌效果.利用壳聚糖表面丰富的氨基和杂多蓝阴离子的强静电吸引作用,一步制备得到杂多蓝/壳聚糖(HPB/CS)纳米粒子.所制备的纳米粒子水溶性良好,溶液水平具有较好的光热转换效果,并且具有良好的抗菌性能,更重要的是,设计合成的HPB/CS纳米材料的抗菌机理与传统的抗菌材料有所不同,不仅通过破坏细菌细胞膜而达到抗菌目的,还可以通过近红外光热辅助破坏细胞,达到增强抗菌的效果.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

壳聚糖(50 kD)购自浙江金壳药业有限公司,Na9PW9O34实验室合成,二甲亚砜(DMSO)购自国药化学集团有限公司.

纳米粒径电位分析仪(Malvern Nano-ZS90),808 nm激光器(FC-808-10W-MM),光热成像仪(FLIR A300).

1.2 杂多蓝/壳聚糖(HPB/CS)纳米材料的制备

称量50 mg壳聚糖,溶解于5.3 mL二次蒸馏水(以下简称二次水)中,摇匀备用.然后称量20 mg杂多蓝[(CH3)4N]5[α-PMo2W10O40]于50 mL单口烧瓶中,加入10.7 mL DMSO溶解,摇匀备用.

将上述两种溶液混合均匀后置于60 ℃油浴中,以800 r/min的转速搅拌反应7 h.停止反应,冷却后将溶液倒入8 000～14 000的透析袋中透析4 h;离心,取离心转速在4 000～19 000 r/min之间的纳米粒子,先用乙醇冲洗1次,再用二次水冲洗2次,将得到的纳米粒子均匀分散于水中.

1.3 纳米粒子溶液光热实验

将制备所得的HPB/CS纳米材料用二次水分别配制成质量浓度依次为0、200、500、800、1 000 μg/mL的纳米粒子水溶液.分别取1 mL溶液置于四面透光的比色皿中,用808 nm (功率密度1 W/cm2)的激光照在比色皿中溶液的正中央.在光照的同时用近红外光热成像仪监控比色皿中溶液的温度变化情况,待溶液升温达到平台一段时间后停止光照(每个浓度依次由低到高进行测试).

材料的光热稳定性是一个需要考虑的重要问题.为了测试其稳定性,取质量浓度为800 μg/mL的材料1 mL于上述比色皿中,首先测试溶液的吸收情况,然后给予上述同等条件的光照,10 min后停止光照,待溶液降温至起始温度后继续光照10 min,如此往复光照-停止-光照,共9个循环,用近红外光热成像仪和计算机系统记录下来整个过程,最后再测一次溶液的吸收情况.

1.4 纳米粒子氨基密度测试

取4 mL的样品管2个,分别放入一片药片并各加入3 mL二次水,超声溶解后对照组加入50 μL二次水,实验组加入50 μL样品,摇匀后静置2 min.以对照组为背景,测其吸收值,取340 nm处的吸光度值A1.两个样品管分别加入100 μL OPA试剂,避光反应15 min.以对照组为背景,测其紫外吸收,取340 nm处的吸光度值A2.用如下公式计算氨基密度:

(1)

其中c=129.74×(A2-A1);cNPs为纳米粒子的质量浓度.

1.5 细菌培养

实验所用的菌种为经典的革兰氏阴性细菌代表大肠杆菌和革兰氏阳性细菌代表金黄色葡萄球菌.将灭菌好的4瓶牛肉汤(100 mL/瓶)置于室温冷却,待冷却到37 ℃左右时用移液枪分别移取菌种各100 μL于其中两瓶牛肉汤中,并将其置于37 ℃的培养箱中培养.12 h后从一代菌液中各取100 μL菌液置于另外两个盛有牛肉汤的备用培养瓶中继续培养12 h.培养结束后各取20 mL菌液于离心管中,以18 000 r/min转速离心,并用灭菌过的二次水洗涤及离心各2遍,离心后用二次水配成与初始浓度相同的菌液以待备用.

1.6 纳米粒子抗菌效果评估

将制备好的纳米材料置于紫外灯下灭菌12 h,用灭菌后的二次水配成质量浓度分别为0、2.5、5.0和7.5 mg/mL的溶液备用.取配置好的纳米粒子溶液5 mL于灭菌试管中,用移液枪移取上述备用菌液100 μL于纳米粒子溶液中,试管放置37 ℃的恒温水浴中振荡,5 h后取出光照组的试管并给予808 nm激光光照1 h(每次照20 min,照完隔30 min再照2次,共1 h),光照结束后继续培养5 h后,将每个试管中溶液按10倍梯度稀释成共5个浓度,取其中两个浓度的菌液100 μL打板(板为事先灭菌过的琼脂板),摇匀后板倒置于37 ℃恒温恒湿培养相中培养24 h,数菌落,计数.

2 结果与讨论

2.1 HPB/CS纳米粒子的制备及表征

对于纳米材料来说,其尺寸和形貌一直是比较受关注的.如图1a,b所示,HPB/CS纳米粒子在水溶液中的水合直径为163±3 nm;Zeta电位测试结果显示HPB/CS纳米粒子平均电位值为21±1 mV.氨基密度测试结果进一步表明纳米粒子表面仍有丰富的氨基,计算结果显示氨基密度为3.84×10-3mol/g.众所周知,细胞表面蛋白质是带负电荷的,带正电荷的材料通过静电相互作用吸附到细胞膜表面,然后通过内吞作用进入到细胞内进而发挥作用,如此看来制备所得HPB/CS纳米粒子适合设计要求.图1c和图1d分别是制备所得纳米粒子的SEM和TEM电镜图,可见纳米粒子分散均匀,粒子平均直径约50 nm.

图1 (a)HPB/CS纳米粒子水合直径分布(DLS)图;(b)HPB/CS纳米粒子在水溶液中的Zeta电位分布图;(c)HPB/CS纳米粒子的SEM图;(d)HPB/CS纳米粒子的TEM图

图2 (a)HPB和HPB/CS纳米粒子的吸收曲线图;(b)不同浓度HPB/CS纳米粒子在溶液的光热(808 nm;1 W/cm2)升温曲线;(c)HPB/CS纳米粒子在近红外光照前后的吸收曲线;(d)HPB/CS纳米粒子光热循环曲线(1 mg/mL)

2.2 HPB/CS纳米粒子抗菌效果评估

考虑到HPB/CS纳米粒子具有较好的光热性能,并且已有的报道也表明HPB具有抗菌效果[20],探讨了HPB/CS纳米粒子在光热辅助下的抗菌效果.根据对未知抗菌材料抗菌效果评估经验,实验选取材料质量浓度以7.5 mg/mL为界限.如图3a中,随着HPB/CS纳米粒子浓度的增加,其对实验细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)的抑制率增大;当HPB/CS纳米粒子浓度达到7.5 mg/mL时,对大肠杆菌抑制率达到83.1%,对金黄葡萄球菌的抑菌率为76.1%.同时实验表明,激光光照组的抑制率比不给激光光照组的要高:当材料质量浓度为7.5 mg/mL时,其对大肠杆菌抑制率达到99%,对金黄葡萄球菌的抑菌率为99.9%.说明合成所得HPB/CS纳米粒子具有很好的杀菌效果,并且在近红外激光的辅助下其抗菌效果更为明显.众所周知,纳米材料表面带正电荷有利于材料通过静电相互作用吸附到细胞膜,然后通过细胞内吞作用进入到细胞里面,通过与细胞内部发生物理或化学作用影响细胞的正常生理活动从而达到杀死细胞的目的.另外本研究所涉及的纳米材料具有较好的近红外光热效果,当材料进入到细胞内部以后,当给予组织渗透性较好的近红外激光(808 nm)以后,材料将来自激光的光能转化为热能,使细胞内部温度升高从而使细菌的细胞消融,如此,在材料本身所具有的抗菌性能基础上达到辅助灭菌的效果.

图3 (a)不同浓度HPB/CS纳米粒子的在不同条件下的抗菌效果图;(b)对应(a)的抗菌效果实图

3 结 论

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(责任编辑：郁 慧,包震宇)

Study on antibacterial properties of chitosan nanoparticles loaded with miscellaneous blue

WANG Jie, YAN Yuping, YANG Hong, YANG Shiping

(College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

As a multi-acid derivative,heteropoly blue has drawn more attention recently owing to its unique physical and chemical properties and has been used in anti-bacterial field.As is well-known,chitosan is widely-used as an antimicrobial agent owing to its high biodegradability,nontoxicity,antimicrobial property,and low price.However,the antibacterial activity of chitosan itself is very low,which needs to be improved.In this article,we synthesized heteropoly blue/chitosan (HPB/CS) nanoparticles utilizing the effective integration of the chitosan amino and negatively charged heteropoly blue by electrostatic interactions.The as-prepared HPB/CS NPs displayed good photothermal conversion ability and antibacterial effect inaqueoussolution.Also,it was found that HPB/CS NPs under 808 nm laser displayed better antibacterial effect than HPB/CS NPs without the laser.

heteropoly blue; chitosan;nanoparticles; photothermal conversion; antibacterial

2016-09-22

国家自然科学基金项目(21371122)

杨 红,中国上海市徐汇区桂林路100号,上海师范大学生命与环境科学学院,邮编:200234,E-mail:yanghong@shnu.edu.cn

O 611.66

A

1000-5137(2016)06-0712-07