生物体系中有机小分子构建的pH值检测荧光探针研究进展

吴庐陵, 黄楚森, 贾能勤

(1.上海师范大学 生命与环境科学学院,资源化学教育部重点实验室,上海 200234;2.上海师范大学 生命与环境科学学院,上海市高校分子影像探针与传感器重点实验室,上海 200234)

生物体系中有机小分子构建的pH值检测荧光探针研究进展

吴庐陵1,2, 黄楚森1,2, 贾能勤1,2

(1.上海师范大学 生命与环境科学学院,资源化学教育部重点实验室,上海 200234;2.上海师范大学 生命与环境科学学院,上海市高校分子影像探针与传感器重点实验室,上海 200234)

由于传统的pH计不能很好地应用在微环境(如亚细胞器)和复杂生物体系中的pH值动态和精确定量检测,因此迫切需要研究可监测复杂多变生物体系中pH值变化且具有高灵敏度的pH值响应分子探针.就近年来用于生物体系(主要是活细胞内)pH值检测的小分子荧光探针作简要综述,同时对目前基于有机小分子构建的荧光探针用于生物体系pH值检测研究及其未来的发展趋势进行展望.

pH值; 比色/荧光; 检测; 荧光探针

生物体系微环境化学反应的进行或完成与pH值密切相关,同样,组织、细胞或酶的许多生理过程如细胞增殖或凋亡、离子运输、内吞作用、多药物耐药性或肌肉收缩等活动也与pH值紧密相关.pH值的改变还会通过间隙连接和信号通路的变化影响到突触传递、神经元兴奋性和细胞间耦合等神经系统活动.细胞内的pH值对细胞内稳态和许多生理过程有着重要的影响[1].例如细胞内酸性亚细胞器的溶酶体,其pH值的改变可能影响着蛋白质降解,细胞膜修复甚至是细胞死亡[2-3].与此同时,细胞内pH值不正常会引发如癌症和阿尔茨海默等一系列疾病,有报道指出细胞酸化是细胞凋亡的早期特征[4].例如肿瘤细胞内的pH值(6.7～7.1)要比细胞外的pH值(7.4)低,而正常细胞内的pH值是7.2,普遍低于其细胞外的pH(7.4).在一定程度上,肿瘤细胞及其微环境的pH值异常促进肿瘤细胞增值、新陈代谢、细胞迁移和侵袭进程[4].因此,实现对生物体系尤其如细胞内溶酶体等微环境的pH变化的动态可视化和定量检测能够更深入地理解受pH值影响的信号转导和相关生理进程,以便依此设计出更好的药物和实现精准医学中的个体化治疗.

1 荧光分析法用于pH值变化的检测

很多生理进程都以细胞为单位发生,因此对于生物体系中pH值的检测通常都以细胞内外的pH值变化为监测对象.在正常生理条件下,根据pH值不同可以把生物体系中的pH值分为细胞外pH值和细胞内pH值.后者又可以划分为两个部分:酸性细胞器(pH值为4.5～6.0)及细胞质(pH值为6.8～7.4).细胞内外酸性或碱性太强,都会引起细胞功能障碍.由于传统的pH值计不能很好地应用于细胞微环境中pH值的检测,因此开发出用于监测复杂多变生物体系微环境中pH值变化的分子探针对于理解pH调控的信号转导和各种生理进程显得极为迫切.

荧光探针检测法是基于荧光信号变化的pH值测定方法,基于有机小分子构建的pH值荧光探针是用一些有机小分子的荧光特性来指示目标介质酸碱度的变化.用荧光探针测定pH值是一种非侵入性的方法,既不会破坏样品,同时具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性低、细胞膜透过性好及测试方法简单等特点.尤其是相比于绿色荧光蛋白等大分子构建的pH值探针,有机小分子荧光探针对生物体系的扰动更小.因此,基于有机荧光小分子探针的pH值检测法利用荧光信号的可视化读出可以实时监测细胞内pH值的变化和动态分布,从而极大地推动了生物体系内pH值相关的信号转导和各类生理进程的研究.基于此,用于检测亚细胞器[5-6]、细胞质[7]和整个细胞[8]pH值变化的荧光探针的设计与开发研究在近年来备受关注.荧光素、萘酰亚胺、花菁和BODIPY等染料在小分子pH值探针的构建方面得到很大程度的应用,这些pH值探针可以通过染料的荧光或颜色的变化实现对pH值的高选择性动态检测[9-11].

1.1 荧光素类

图1 荧光素的质子化和去质子化过程[11]

荧光素具有较长发射波长、高量子产率[12]的特点,是最早的pH值荧光探针之一,其荧光性质随pH值变化而变化.当pH≤5时,荧光素是荧光很弱的中性分子,伴随着螺环结构存在;当pH≥6.5时,其为带2个负电荷的形式,荧光发射强度较大[13](图1).然而荧光素分子容易从细胞内流失这一缺陷限制了其在细胞参数表征方面的应用[13].为了解决这一问题,人们开展了多种荧光素衍生物的pH值探针[14-17].

图2 荧光素与单壁碳纳米管非共价结合形成的高水溶性pH值荧光探针[18]

Nakayama-Ratchford等[18]设计了荧光素-聚乙二醇以π-π堆积方式形成功能化的单壁碳纳米管Fluor-PEG/SWNTs.Fluor-PEG/SWNTs是分子开关“off-on”型的高水溶性pH值荧光探针,荧光素和单壁碳纳米管的连接效果依赖pH值的变化;pH值增大,其连接效果差,即Fluor-PEG/SWNTs在高pH值条件下不稳定,探针的荧光强度会相应减弱.另外,该探针可被哺乳细胞吞噬,可以用于细胞标记,同时拉曼分析结果表明荧光素成功地和单壁碳纳米管连接.

1.2 罗丹明类

Yu[19]等以罗丹明B为基础通过“click reaction”得到了可开环的螺环pH值探针RhP和RhPA (图3),其pKa值分别是4.79和5.23.这两个探针具有高灵敏度、选择性好的特点,且为长波长荧光发射;RhPA较低的细胞毒性和优越的光稳定性可用于活细胞内酸性细胞器溶酶体的可视化荧光成像.

图3 RhP和RhPA的pH值响应机理[19]

1.3 BODIPY类

图4 基于PET机理的荧光分子传感器1a

BODIPY类荧光染料光稳定性好,荧光量子产率高,摩尔消光系数高,然而其母体结构难以引入活性基团,极大地限制了其在生物学领域中的应用.Hall[20]等以BODIPY为骨架设计合成了off-on型荧光探针1a(图4),该探针是典型的光诱导电子转移(PET)机理探针,且可以被近红外光区域波长的光激发.通过对其在不同极性溶剂中的光谱性质进行研究发现,荧光强度随溶剂极性增大而增大;在PBS缓冲溶液中,其pKa值为6.9,荧光强度随pH值的减小而增大,在响应的pH值检测范围(pH值工作窗口)内荧光强度增加了近3倍.该探针被用来对HeLa细胞进行荧光成像,主要分布在细胞质中,具有良好的成像效果.

1.4 萘酰亚胺类

图5 化合物5和7的结构[21]

萘酰亚胺类荧光染料色泽鲜艳、荧光量子产率较大,是一类极其重要的功能染料.2008年Bojinov[21]等设计合成两种基于萘酰亚胺的具有pH值响应的分子传感器.化合物5和7(图5)荧光发射是黄绿色,在N,N-二甲基甲酰胺和水/N,N-二甲基甲酰胺(1∶4,v/v)体系中分别研究了两个化合物的光物理性质,表明化合物5的荧光发射对pH值不敏感,而化合物7在较宽的pH值范围内荧光变化明显.这一现象是由于5的哌啶氨基质子化更弱,而7可以是很好的“off-on”型荧光pH值探针,其PET机理如图6所示.

图6 pH探针7的PET机理[21]

1.5 花菁和半花菁类

图7 基于花菁染料的pH探针结构

花菁和半花菁类染料在最大吸收波长处有高的摩尔消光系数以及良好的水溶性,同样具有低的细胞毒性,并且已广泛应用在比色、荧光传感中[22-24].申请公布号为CN 104086536 A的中国发明专利公开了一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒.该发明提供的用于检测pH值的荧光探针的结构如图7所示.该发明提供的用于检测pH值的试剂盒,包括上述化合物和溶剂.上述专利公布的技术方案中,制得的荧光探针及其专用检测试剂盒对溶液的pH值具有良好的响应性,能够实现对溶酶体的标记和细胞溶酶体pH值的测定,但其pH值检测范围较窄,且仅限于细胞溶酶体pH值的检测,适用范围较小,有很大的局限性.

图8 CPH检测pH值的原理及其荧光/比色双模态成像

早期的pH值探针设计中,大多数pH值荧光探针都具有发射波长单一的特点[10-11,25-26],在实际复杂生物体系检测中染料聚集和长时间光激发很容易引起荧光的淬灭,从而影响该类探针工作的稳定性.因此,用这些单发射波长探针检测pH值,尤其是定量检测需要前期校准.比值型检测机理可以克服这类问题.近年来,一些课题组设计制备出了pH值响应并可用于细胞内pH值检测以及活细胞成像的比值型pH值荧光探针[8,10,22,27-32].然而,这些比值型探针专注于细胞能pH值变化的检测,而且多不能够对实现对pH值比色检测.大多数的花菁和半菁类pH值探针通过菁染料吲哚环的N原子实现荧光的“off-on”变化,虽然可以将其与聚集态诱导发光染料[33-34]、罗丹明染料[35]、喹啉[29]和苯并噻唑[36]连接作为FRET的受体或供体,这样构建出比值型荧光pH值探针,但是上述连接需要巧妙或复杂的分子结构设计.另外,花菁和半花菁类染料可裸眼观察实现比色方式检测pH值的研究鲜有报道.所以,本课题组[12]最近设计、合成了一种新型基于半菁染料的比值型分子探针(CPH),该探针可很好地实现比色和荧光双模态检测pH值(图8).它主要由两部分构成,一部分是连接在吲哚半花菁氮原子位置的苄基,另一部分是作为pH值受体的粉羟基.与此前报道的吲哚半花菁类pH值探针不同,CPH具有如下特性:1)在吲哚环的氮原子位置引入苄基可以提高这个吲哚半花菁染料的稳定性,从而抑制了OH-对CPH的亲核加成.使得CPH对于质子的检测原理与曾经报道的OH-对C=N亲核加成这一普遍机理不同;2)苯酚基团对pH值变化的响应是形成酚和酚盐两种结构形式,且这两种结构具有可逆性.基于这种结构-性质的关系,CPH可以实现比色/荧光双模态检测pH值的变化;3)CPH可以作为活细胞内溶酶体探针且对溶酶体内pH值变化可以通过双波长的荧光信号进行检测;4)CPH同样可以固载制成pH值试纸,该试纸对酸性及碱性蒸汽具有高敏度的比色变化,并且可以裸眼观察.

2 展 望

综上所述,迄今为止基于有机小分子的pH值荧光探针对于推动在生物医学领域研究发挥着重要作用,相关报道已经很多,尤其是单光子pH值荧光探针.为了更好地在生物体系中实现对pH值变化实时、高灵敏度、原位和便捷地检测,今后的相关研究工作可以集中在如下几个方面:1)开发双光子探针,以降低生物自发荧光背景干扰,进一步提高探针检测的灵敏度;2)相比于开关型小分子荧光探针,比值型荧光探针在检测时通过荧光光谱图两个荧光峰强度变化对同一物质进行检测,使其具备了内在的自校准功能,因而在生物体系中对于pH值的定量检测结果更为准确和可靠.因此,发展有机小分子pH值荧光探针仍然是未来研究的一个重要方向;3)开发出稳定的近红外pH值荧光探针,有利于穿透更深的生物组织,从而可以实现活体内微环境的pH值变化检测;4)发展基于小分子探针的pH值传感器,并将其与手机应用软件结合,制作出可穿戴式的pH值设备,实现对人体等生物体系中微环境pH值的快速动态检测.

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(责任编辑：包震宇,郁 慧)

Progress of fluorescent probes based on small organic molecules for pH value detection in biological systems

WU Luling1,2, HUANG Chusen1,2, JIA Nengqin1,2

(1.Key Laboratory of Resource Chemistry,Ministry of Education,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;2.Shanghai Municipal Education Committee Key Laboratory of Molecular Imaging Probes and Sensors,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

As traditional pH meters cannot work well for the real-time determination and quantitative detection of pH value changes in microenvironments (such as subcellular organelles) and complex biological systems,molecular pH-sensitive probes for monitoring pH changes in complicated and changeable biological systems are urgently needed.This review focuses on the current progress in small molecular fluorescence probes for the detection of pH value changes in biological systems (mainly in monitoring the pH fluctuation in the live cell).Future development of fluorescent probes for pH value detection in the biological systems was also discussed.

pH value; colorimetric/fluorescence; detection; fluorescent probe

2016-09-22

国家自然科学基金面上项目(21373138,21672150);国家自然科学基金青年科学基金(21302125);教育部博士点新教师基金(20133127120005);上海市晨光计划(14CG42)

黄楚森,中国上海市徐汇区桂林路100号,上海师范大学生命与环境科学学院,邮编:200234,E-mail:huangcs@shnu.edu.cn;贾能勤,中国上海市徐汇区桂林路100号,上海师范大学生命与环境科学学院,邮编:200234,E-mail:nqjia@shnu.edu.cn

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A

1000-5137(2016)06-0742-06