1例手足口病患者及其密切接触者的病原检测与序列分析

庄志超 颜丙新 郝树彬 姜文国 白永娟 李纯 鲁燕 赵丽 王志玉 温红玲

250012济南，山东大学（庄志超、白永娟、李纯、鲁燕、赵丽、王志玉、温红玲）；272000济宁市疾病预防控制中心（颜丙新、姜文国）；250101济南，山东省医疗器械产品质量检验中心（郝树彬）

1例手足口病患者及其密切接触者的病原检测与序列分析

庄志超 颜丙新 郝树彬 姜文国 白永娟 李纯 鲁燕 赵丽 王志玉 温红玲

250012济南，山东大学（庄志超、白永娟、李纯、鲁燕、赵丽、王志玉、温红玲）；272000济宁市疾病预防控制中心（颜丙新、姜文国）；250101济南，山东省医疗器械产品质量检验中心（郝树彬）

目的对山东省济宁市手足口病患者及其接触者标本进行病毒分离以及基因组序列测定与分析，捕捉病毒在传播过程中的变异情况。方法使用RD细胞分离病毒，通过8对位于保守区的首尾重叠的全序列扩增引物进行扩增和序列的测定与拼接，并对全基因序列以及氨基酸序列与肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）各亚型标准株进行同源性分析以及遗传进化分析。结果自1例患儿及其密切接触者各分离得到1株EV71分离株，分别命名为SDJN2015⁃01和SDJN2015⁃01.1；同源性分析显示分离到的两株病毒与C4a亚型株EU703813同源性最高；遗传进化分析显示两株病毒同属于C4a亚型。序列比对发现，两株病毒共存在12个核苷酸的差异，导致6个氨基酸的差异，分别为VP1区K98E（全编码区为K663E）和A133T（A698T）以及2C区D48N（D1159N）、V126I（V1237I）、I238V（I1349V）和N314Y（N1425Y）。结论SDJN2015⁃01和SDJN2015⁃01.1株同属EV71 C4a亚型，其与C4a亚型标准株EU203813具有高度同源性；两株病毒间在VP1和2C区产生的氨基酸的变异对病毒毒力以及感染能力是否有影响有待进一步研究。

Fund programs：Fund programs：National Nature Science Foundation of China（81371833）；Medical and Health Science and Technology Development Plan of Shandong Province（2013WS0211）

手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）是由多种肠道病毒引起的病毒性传染性疾病，肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是引起手足口病的主要病原体之一。EV71的感染除了可以导致手足口病的常见症状外，还可引起神经性肺水肿、脑炎、无菌性脑膜炎等一系列中枢神经系统并发性，严重时可导致患者死亡［1］。

我国自2008年以来，连续多年均出现EV71引起的手足口病流行。近年虽由于手足口病病原谱的变化，EV71感染所占比重有所下降，但仍占据较为重要的位置［2］。山东省一直是手足口病的高发区，其中EV71为重要的病原体之一［3⁃5］。目前针对EV71感染导致的手足口病已经有疫苗上市可供使用［6］，但目前治疗方面仍没有特效的抗病毒药物可以使用，还是以对症以及支持治疗为主。

本研究对2014年山东省济宁市手足口病患者及其密切接触者的粪便标本进行病毒分离培养，并对分离得到的EV71病毒进行基因序列的测定与分析，以期获得其基因特征，了解病毒在传播过程中的变异情况。

1 材料与方法

1.1 标本与细胞标本由济宁市任城区疾病预防控制中心采集，采集自仅有疱疹的五岁轻症手足口病男性患儿以及其密切接触者，共采得患者粪便标本一份、密切接触者粪便标本15份。人横纹肌肉瘤细胞（Rhabdomyosarcoma cells，RD）为山东省疾病预防与控制中心惠赠。

1.2 主要仪器及试剂胎牛血清购自BI公司，DMEM购自Hyclone公司。胰酶购自MACGENE公司。一次性细胞培养瓶以及一次性细胞培养板购自Corning公司。DH5⁃α感受态由本科室制备保存。限制性核酸内切酶购自ThermoScientific公司。pMD⁃19T质粒载体、ExTaq聚合酶、PrimeSTARGXL聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒、病毒RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司。逆转录试剂盒购自TOYOBO公司。西班牙琼脂糖Regularagarose G⁃10购自Biowest公司。电泳缓冲液50×TAE购自Solarbio公司。

1.3 病毒的分离将预处理好的样本接种到生长至70%⁃80%、形态良好的单层RD细胞上，同时设置正常细胞对照，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，每日观察细胞病变情况。当细胞病变达到＋＋＋时收获病毒。

1.4 病毒的鉴定使用病毒RNA提取试剂盒提取病毒分离培养液中的病毒RNA，使用逆转录试剂盒将提取到的病毒RNA逆转录为cDNA。同时使用肠道病毒通用引物、柯萨奇病毒A16型引物以及EV 71型引物进行PCR扩增，扩增程序为：预变性95℃10 min；变性95℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃20 s，共30个循环；终末延伸72℃10 min后结束反应。

1.5 引物设计通过对GenBank上不同时间、地区的EV71全基因序列进行分析后，在病毒基因序列的保守区设计了8对首尾重叠的全序列扩增引物（表1）

表1 EV71全基因序列扩增引物Tab.1 Primers used for amplifying the whole genome of EV71

1.6 病毒基因片段扩增使用PrimeSTAR GXL高保真聚合酶对病毒全集因进行分段PCR扩增，扩增程序为：预变性95℃4min；变性98℃10 s，退火55℃20 s，延伸68℃1 kb／min，共35个循环；终末延伸78℃10 min后结束反应。

1.7 病毒基因片段克隆使用DNA凝胶回收试剂盒回收病毒扩增片段，通过T⁃A克隆的方法连接到pMD⁃19T载体上，然后转化进入DH5⁃α感受态大肠杆菌中，通过蓝白斑筛选挑取阳性菌落。对阳性菌落摇菌扩增后使用质粒提取试剂盒提取质粒，对所提取的质粒使用XbaI与HindIII限制性核酸内切酶进行酶切，对酶切产物使用1%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析。阳性结果送上海博尚公司进行基因测序。

1.8 序列以及遗传进化分析使用MEGA 6软件构建系统发生树进行遗传进化分析，使用DNASTAR 7.0软件进行序列分析。用于进行分析比对的各株EV71全基因以及VP1基因序列均来自GenBank。

2 结果

2.1 病毒的分离鉴定及序列测定在16份标本中，共分离得到两株病毒，其中一株分离自患者标本、另一株分离自其密切接触者标本。将两株病毒使用全基因序列扩增引物进行PCR扩增后送往测序公司进行基因序列的测定。

2.2 病毒全基因序列的分析通过对病毒8个片段进行测序以及拼接，获得了两株EV71病毒的全序列，分离自手足口病患者的毒株命名为SDJN2015⁃01，分离自其密切接触者的毒株命名为SDJN2015⁃01.1。两株病毒全基因组核苷酸序列长度均为7 405 bp，其中未含多聚腺苷酸尾。两株病毒5′UTR区均为742 bp长度，基因组编码区为6579 bp，编码含有2 193个氨基酸的多聚蛋白，3′UTR区为84 bp长度。这两株病毒在基因组的特征与结构上均符合肠道病毒的特征。

2.3 病毒全基因组核苷酸与氨基酸的同源性比较

将SDJN2015⁃01与GenBank中得到的EV71各基因（亚）型的代表株进行核苷酸与氨基酸序列的同源性比较。

核苷酸同源性比较结果显示，SDJN2015⁃01株在全基因组序列上同EV71原型株U22521核苷酸同源性最低，为80.2%；而与C4a亚型株EU703813同源性最高，为97%。而对各个分区进行比较，在5′UTR区、VP4、VP2、VP3、VP1以及2A、2C、3B编码区上，SDJN2015⁃01株与原型株U22521核苷酸同源性均为最低，分别为80.3%、80.7%、80.6%、81%、82.9%、80.4%、77.9%及65.2%；而在2B、C2编码区上，SDJN2015⁃01株与C2亚型株AF119795同源性最低，分别为73.7%与72.3%；在3A编码区以及3′UTR区上，SDJN2015⁃01株与C5亚型株EU527983同源性最低，为72.5%；在3D编码区上，SDJN2015⁃01株与B亚型株ETU22522同源性最低，为75.9%。而SDJN2015⁃01与C4a亚型株EU703913在各个编码区与非编码区上同源性均为最高。

而氨基酸同源性比较结果显示，SDJN2015⁃01株与C4a亚型EU703813株在编码区各个部分同源性均为最高。而SDIN2015⁃01株与C1亚型DQ341361株在VP4编码区同源性最低，为97.1%；与B亚型ETU22522株在VP2、VP3区同源性最低，分别为97.2%和97.1%；与C2亚型AF119795株在VP1、2B、2C、3A、3B、3C以及3D编码区同源性均为最低，分别为93.9%、91.9%、90.9%、88.4%、81.8%、80.3%以及89.8%；与A亚型U22521株在2A区同源性最低，为94%。

2.4 病毒遗传进化分析基于病毒的VP1区序列，通过MEGA6软件，使用邻接法（Neighbor⁃joining）对两株病毒以及从GenBank上得到的EV71各基因（亚）型代表株进行遗传进化分析，结果见图1。

由图1可以看出，SDJN2015⁃01以及SDJN2015⁃01.1株均处于C4a分支，属于C4a亚型。

2.5 SDJN2015⁃01株与SDJN2015⁃01.1株核苷酸及氨基酸序列比对由于该两株病毒分别分离自一名手足口病患儿及其接触者，因此对该两株病毒进行序列比对有助于发现病毒在传播过程中发生的变异情况。

对两株病毒进行核苷酸及氨基酸序列比对后，结果发现，SDJN2015⁃01株与SDJN2015⁃01.1株在核苷酸序列上存在12个核苷酸的不同（7393／7405），其中5′UTR区存在一个核苷酸的差异（741／742）、VP1区存在4个（887／891）、2A区存在1个（449／450）、2C区存在4个（983／987）、3D区存在2个（1384／1386）。在这些核苷酸的差异之中，共导致氨基酸的改变有6处，其中VP1区存在2个氨基酸的差异，分别为K98E（全编码区为K663E）和A133T（A698T）；2C区存在4个氨基酸的差异，分别为D48N（D1159N）、V126I（V1237I）、I238V（I1349V）和N314Y（N1425Y）。上述6个氨基酸位点的改变发生于病毒在人群中的自然传播过程中，是否有助于增强病毒对人体的感染能力或是对病毒毒力的改变产生了影响仍需进行进一步的分析探讨。

3 讨论

EV 71型病毒核酸为单股正链RNA，基因组全长7.4 kb左右，仅含有一个开放阅读框架，编码含有2193个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白进一步被水解为4个结构蛋白（VP1⁃VP4）和7个非结构蛋白（2A⁃2C，3A⁃3D），其中结构蛋白VP1含有病毒主要的抗原决定簇，而其高度的遗传多变性使得目前基于VP1区基因序列的EV71分型是目前病毒主要的分型依据。根据病毒VP1序列的不同，EV71被分为A、B、C三个基因型，其中B型与C型各自又分5个亚型。近年来，我国大陆主要的流行株为C4亚型。本研究分离得到的两株病毒SDJN2015⁃01与SDJN2015⁃01.1经分析均属于C4a亚型，与目前我国EV71的流行优势株相符。

▲：SDJN2015⁃01，■：SDJN2015⁃01.1图1 SDJN2015⁃01株与EV71各基因型VP1区的基因进化树Fig.1 Phylogenetic tree of VP1 region of SDJN2015⁃01 strain and the representatives of each subgenogroup

EV71感染导致的手足口病可分为轻症和重症两种。轻症的手足口病患者仅出现发热以及手足口周的疱疹，预后较好。而重症的手足口病可出现严重的神经系统并发症，严重时甚至可以导致患者死亡。这种不同的临床表现是由多种因素联合作用引起的，其中就包括病毒毒力的不同。许多研究都认为，EV71编码区氨基酸序列的改变可能是导致其病毒毒力改变的原因。Victorio等人研究发现［7］，VP1蛋白第98位、第145位以及第169位氨基酸可能与病毒结合细胞表面受体的能力有关，当VP1蛋白第98位为E、145位为A、169位为F时，EV71能够更好地结合细胞表面的受体，使得其对细胞的感染能力增强。而Kataoka等人的研究发现［8］，当VP1蛋白第145位氨基酸为E时，病毒的毒力有了显著性的提高。此外，还有研究发现，EV71病毒VP1蛋白第97位、第244位氨基酸的改变也会对病毒的毒力产生影响［9，10］。本研究分离得到的两株病毒在VP1蛋白第98位氨基酸位点上发生了K→E的突变，这一变化有可能是使得病毒致病性增强的重要因素；而在A133T这一变化的意义有可能也会改变病毒对人体的感染能力，当仍需进一步的研究探索。

2C蛋白在EV71病毒中具有高度的保守性，其在病毒感染过程中参与病毒复合体的形成［11，12］。有研究发现，2C蛋白在病毒感染的过程中能够抑制NF⁃κB的活化，这或许是病毒对抗机体固有免疫的方式［10］。另有研究指出，2C蛋白可以通过抑制IKKβ的磷酸化来最终抑制NF⁃κB信号传导通路的作用，来影响病毒对机体的侵染［12］。但目前对2C蛋白中氨基酸位点突变的影响研究仍然较少，本研究发现的4个氨基酸位点的变异是否会影响2C蛋白的功能，以至于对病毒与机体之间的相互作用产生了影响，最终影响到病毒的致病能力，这些仍有待于更深一步的研究。

本研究通过对手足口病患者标本进行分离，得到两株新的EV71毒株，进一步完善了中国尤其是山东省的EV71病毒基因信息；同时捕捉到了EV71病毒在自然传播过程中产生的变异，为该病毒致病机制的研究提供了一定的线索。

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Pathogen and its sequence analysis of a hand，foot and mouth disease case and its close contacts

Zhuang Zhichao，Hao Shubing，Bai Yongjuan，Li Chun，Lu Yan，Zhao Li，Wang Zhiyu，Wen Hongling

Shandong University，Jinan 250012，China（Zhuang ZC，Bai YJ，Li C，Lu Y，Zhao L，Wang ZY，Wen HL）；Jining Center for Disease Control and Prevention，Jining 272000，China（Yan BX，Jiang WG）；Shandong Quality Inspection Center for Medical Devices，Jinan 250101，China（Hao SB）．

Wen Hongling，Email：wenhongling＠sdu．edu．cn

ObjectiveIsolating，sequencing and analyzing the viruses from a hand，foot and mouth disease case and its close contacts and capturing the variation during the viruses transmission.MethodsThe viruses were isolated using RD cells.The complete genome was amplified，sequenced and analyzed.ResultsTwo strains of Enterovirus 71（EV71）were gotten from the case and one close contact，which named as SDJN2015⁃01 and SDJN2015⁃01.1 respectively.Sequence analysis showed that these two strains shared high homology with EU703813 of genotype C4a.Meanwhile，the results of phylogenetic analysis based on VP1 region revealed that all these two strains belonged to genotype C4a.By comparing the genomes of these two strains，twelve nucleotide differences were found，leading to six amino acid mutations.Among these six amino acid mutations，two of which located in VP1 region（K98E and A133T）and the rest located in 2C region（D48N，V126I，I238V and N314Y）.ConclusionsNewly isolated EV71 strains，SDJN2015⁃01 and SDJN2015⁃01.1，belonged to genotype C4a and these two strains shared high homology with strain EU703813.Whether the amino acid mutations in VP1 and 2C regions from the two strains were associated with the virus virulence and infection ability need to be further explored.

Enterovirus 71；homological analysis；phylogenetic analysis；amino acid mutation

温红玲，Email：wenhongling＠sdu.edu.cn

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

EV71；同源性分析；遗传进化分析；氨基酸变异

国家自然科学基金（81371833）；山东省重点研发计划项目（2015GSF118162）

2016⁃08⁃03）