2014⁃2015年北京市顺义区急性胃肠炎成年患者中诺如病毒分子进化规律分析

张爽 荆红波 马红梅 靳淼 李颖

101300北京市顺义区疾病预防控制中心（张爽、荆红波、马红梅、李颖）；102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（靳淼）

2014⁃2015年北京市顺义区急性胃肠炎成年患者中诺如病毒分子进化规律分析

张爽 荆红波 马红梅 靳淼 李颖

101300北京市顺义区疾病预防控制中心（张爽、荆红波、马红梅、李颖）；102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（靳淼）

目的目的了解北京市顺义区急性胃肠炎成年患者中诺如病毒的感染规律及其基因特征。方法采集2014年1月至2015年12月北京市顺义区肠道门诊急性胃肠炎成年患者的粪便标本240份，并收集患者的流行病学资料。标本进行诺如病毒实时荧光定量PCR（Real⁃time PCR）检测，阳性标本应用逆转录PCR（Reverse transcription⁃PCR，RT⁃PCR）扩增诺如病毒RNA依赖性RNA聚合酶基因（RNA⁃dependent RNA polymerase，RdRp），并进行序列测定和基因分析。结果240份标本中诺如病毒阳性检出率23.33%（56／240），以GⅡ群为主（20.83%，50／240），GⅠ群次之（2.50%，6／240）；男女阳性检出率无统计学差异（χ2＝0.21，P＝0.65）；2014⁃2015全年均有诺如病毒检出，高峰在11月至次年3月。RdRp区序列分析显示，2014年诺如病毒GⅡ.4型最多（37.50%，6／16），2015年GⅡ.17型最多（71.43%，20／28）；所得的11条GⅡ.4型RdRp区序列与2009年之前的GⅡ.4型参考株不在同一个进化分枝，且同源性差异较大，而与2012年澳大利亚Sydney NSW0514株等近年参考株在同一个进化分枝，且同源性差异较小；所得的23条GⅡ.17型RdRp区序列与各GⅡ.17型参考株均位于同一进化分枝，虽然实验株与参考株的核苷酸同源性有所差异，但有氨基酸差异的只有14115和15017两株。结论北京市顺义区急性胃肠炎成人患者中诺如病毒的主要流行基因型在2014年为GⅡ.4型，2015年转变为GⅡ.17型，且存在多种基因型共同流行的特点。

Fund programs：National Science and Technology Major Project of China for Infectious Disease（2012ZX10004215）；Project specialized for Health（201302004）

诺如病毒被称为“冬季呕吐病”［1］，是全球急性病毒性胃肠炎的重要致病原之一，易导致急性胃肠炎暴发疫情［2］。诺如病毒属于杯状病毒科［3］，为单股正链RNA病毒，根据基因差异可分为GI‐GVI 6个基因群，其中GI和GII群是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因群［4］。诺如病毒的基因变异速度很快，自1995年起，全球报道了多起GII.4型基因变异株引起的急性胃肠炎暴发流行［5⁃7］。而2014年冬季以来，全球报道的诺如病毒GII.17型新变异株引起的急性胃肠炎暴发疫情大幅增加［8，9］，中国各地也同时报道了相关疫情［10⁃13］，2015年3月北京市顺义区暴发了一起由诺如病毒GII.17型新变异株引起的急性胃肠炎暴发疫情。因此，监测急性胃肠炎患者中诺如病毒的感染情况十分必要。为了了解北京市顺义区急性胃肠炎成年患者中诺如病毒的感染情况及其基因特征，进行了本次研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源2014年1月至2015年12月期间，每月随机抽取10份北京市顺义区各医院肠道门诊采集的急性胃肠炎成年患者粪便标本，共240份。患者发病在3天以内，且就诊前未使用过抗生素。标本低温冷藏运送至北京市顺义区疾病预防控制中心进行下一步检测。

1.2 标本处理在1.5 ml EP管中加入1 ml HBSS标本处理液后，加入0.1 g固体粪便标本或0.1 ml液体粪便标本，制成10%的便悬液。涡旋振荡3次，室温静置10 min，5 000 r／min离心5 min，取上清待用。

1.3 病毒RNA提取使用德国Qiagen公司RNA提取试剂盒QIAamp®Viral RNA Mini Kit（Cat.No. 52906）提取便悬液上清中的病毒核酸，实验操作按照试剂说明书进行。所提核酸暂存于－70℃或立即进行下一步检测。

1.4 Real⁃time PCR使用江苏硕世公司诺如病毒GⅠ／GⅡ核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号：JC50201）对标本进行诺如病毒初筛，反应体系按照试剂说明书配制。PCR扩增和结果判读使用美国ABI公司ViiA7型实时荧光定量PCR仪。扩增曲线呈典型S型且CT≤35.5的标本结果判定为阳性，无典型S型扩增曲线或CT＞35.5的标本结果判定为阴性。Real⁃time PCR结果阳性的标本进行下一步诺如病毒RdRp区RT⁃PCR。

1.5 RT⁃PCR使用美国Invitrogen公司PCR试剂盒SuperScript®ⅢOne⁃Step RT⁃PCR with Platinum® Taq（Cat no.12574⁃026）进行序列扩增，反应体系按照试剂说明书配制。扩增诺如病毒RdRp区使用的混合引物为改良过的P290／P289［14］，见表1。使用美国伯乐公司iCycler型PCR仪进行扩增反应，程序为：50℃逆转录30 min；94℃预变性15 min；94℃1 min、50℃80 sec、72℃1 min，扩增40个循环；72℃延伸10 min。PCR产物使用德国Qiagen公司QIAxcel Advanced全自动毛细管电泳仪进行毛细管电泳，使用试剂盒为QIAxcel DNA Screening Kit（Cat no.929004）。电泳结果在331bp左右有条带的产物送上海生工生物公司进行双向测序。

1.6 系统进化和同源性分析测序得到的诺如病毒RdRp区序列使用Sequencher 4.8软件进行序列比对。将所得的RdRp区序列与GenBank数据库中下载的参考序列使用MEGA 5.0软件建立系统进化树，以确定诺如病毒分型，同时进行核苷酸和氨基酸同源性分析。

1.7 统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计学分析，组间计数资料的比较应用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 诺如病毒RdRp区RT⁃PCR引物Tab.1 RT⁃PCR primers of norovirus RdRp

2 结果

2.1 诺如病毒Real⁃time PCR检测结果在240份急性胃肠炎成年患者的粪便标本中，用Real⁃time PCR法检出诺如病毒阳性标本56份，阳性检出率23.33%（56／240）。其中，2014年阳性检出率21.67%（26／120），2015年25.00%（30／120），两者无统计学差异（χ2＝0.37，P＝0.54）。

240份标本中，诺如病毒GⅠ群阳性检出率2.50%（6／240），GⅡ群20.83%（50／240），两者有统计学差异（χ2＝39.14，P＝0.00）。男性患者阳性检出率24.32%（36／148），女性患者21.74%（20／92），两者无统计学差异（χ2＝0.21，P＝0.65）。其中，男性患者GⅠ群阳性检出率3.38%（5／148），女性1.09%（1／92），两者无统计学差异（χ2＝0.46，P＝0.50）；男性患者GⅡ群阳性检出率20.95%（31／148），女性20.65%（19／92），两者无统计学差异（χ2＝0.00，P＝0.96）。由于标本采自成人，故Real⁃time PCR诺如病毒阳性的患者也均为20岁以上的成年人。

2.2 诺如病毒感染的月分布如图1所示，2014⁃2015年诺如病毒在北京市顺义区全年均有检出，高峰主要分布在11月至次年3月。各月的阳性检出率最高为35.00%（7／20），出现在1、2、3和11月4个月份。诺如病毒GⅠ群仅在4⁃8月有检出，GⅡ群的月份分布趋势与诺如病毒总体月份分布趋势基本一致。

2.3 诺如病毒系统进化分析对标本进行诺如病毒RdRp区RT⁃PCR后，共得到序列44条，其中2014年和2015年分别得到16和28条序列。使用MEGA 5.0将所得的序列与选取的诺如病毒参考株RdRp区序列建立系统进化树，如图2。根据系统进化树，可知感染标本的诺如病毒分型。

图1 2014⁃2015年北京市顺义区诺如病毒阳性患者月份分布Fig.1 Monthly distribution of norovirus⁃positive patients in Shunyi district of Beijing from 2014 to 2015

2014年的16条序列中，GⅡ.4型最多，有6条；其次为GⅡ.7型，4条；GⅡ.17型3条；GⅡ.3、GⅠ.2和GⅠ.9型各1条。2015年的28条序列中，GⅡ.17型最多，有20条；其次为GⅡ.4型，5条；GⅡ.16、GⅠ.2和GⅠ.6型各1条。

所得的11条GⅡ.4型RdRp区序列与2009年之前曾引起诺如病毒暴发流行的日本Kobe034株、美国VA98387株和New Orleans 1805株并不在同一个进化分枝上，但与近年来引起暴发流行的2012年澳大利亚Sydney NSW0514株、2014年广州L106、L132和L295株在同一个进化分枝上，GⅡ.17型的23条序列均位于同一进化分枝。

2.4 诺如病毒同源性分析将所得的44条RdRp区序列按诺如病毒分型分为GⅠ和GⅡ两组，使用MEGA5.0进行核苷酸和氨基酸两两比较，得到GⅠ组各序列间核苷酸同源性63.44%⁃98.86%，氨基酸同源性81.31%⁃100.00%；GⅡ组核苷酸同源性53.41%⁃100.00%，氨基酸同源性60.08%⁃100.00%。GⅠ组组内平均核苷酸差异26.94%，氨基酸差异11.62%；GⅡ组组内平均核苷酸差异21.18%，氨基酸差异12.60%；GⅠ和GⅡ两组组间平均核苷酸差异57.66%，氨基酸差异49.37%。

图2 诺如病毒RdRp区核苷酸序列系统发生树Fig.2 Neighbor⁃Joining Tree of RNA⁃dependent RNA polymerase region among norovirus in Shunyi

所得的11条GⅡ.4型RdRp区序列与7条GⅡ.4型参考株序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析，得到与系统进化分析相似结果：与所得序列核苷酸差异最大的参考株是2009年引起美国诺如病毒暴发流行的New Orleans 1805株，核苷酸同源性79.97%⁃81.86%；其次为2006年日本Kobe034株（80.91%⁃81.87%）和1998年美国VA98387株（82.32%⁃83.24%）；所得序列与2012年澳大利亚Sydney NSW0514株核苷酸差异较小（96.63%⁃98.15%）；与2014年广州各株差异最小，与L106、L132和L295株核苷酸同源性分别为98.15%⁃100%、97.77%⁃100%和97.01%⁃99.26%。与所得序列氨基酸差异最大的参考株是2006年日本Kobe034株，氨基酸同源性90.96%⁃91.81%；其次为1998年美国VA98387株和2009年美国New Orleans 1805株，氨基酸同源性均为91.19%⁃92.00%；2012年澳大利亚Sydney NSW0514株、2014年广州各株除与实验所得的15117株氨基酸有差异，氨基酸同源性均为98.90%，与其他所得序列的氨基酸同源性均为100.00%，氨基酸差异最小。

所得的23条GⅡ.17型RdRp区序列与7条GⅡ.17型参考株序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析：与所得序列核苷酸差异最大的参考株是2014年日本Kawasaki323株，核苷酸同源性94.27%⁃98.15%；其次为2013年日本Saitama5309株（94.67%⁃98.52%）；所得序列与2014年河北wan 1、wan 4株核苷酸同源性分别为92.64%⁃99.63%、93.07%⁃99.63%；与2015年顺义RdRp⁃290株、韩国CAU⁃267株和2014年上海142700株核苷酸差异最小，核苷酸同源性均为93.07%⁃100%。与参考株序列有氨基酸差异的实验所得序列有14115和15017，它们与2014年河北wan 1株氨基酸同源性分别为91.81%和95.35%，与其他参考株序列的氨基酸同源性均为91.90%和95.40%。其他所得GⅡ.17型RdRp区序列与7条GⅡ.17型参考株的氨基酸同源性均为100%。

3 讨论

诺如病毒是全球急性病毒性胃肠炎的重要致病原之一，疾病负担严重。诺如病毒的高度传染性和快速传播能力及其潜伏期相对较短［15］的特点，使其易导致急性胃肠炎暴发疫情［2］。据报道，急性胃肠炎患者中约1／5诺如病毒检测阳性，且各年龄段人群普遍易感［16］。我国研究也显示，在急性胃肠炎患者中诺如病毒感染的比例较其他病原体高［17］。本研究结果显示，在急性胃肠炎成年患者中，诺如病毒的检出率约为1／5，与之前报道相符［16］。男女检出率无统计学差异。

据报道，每年10月至次年3月是诺如病毒引起的急性胃肠炎的高发期［1］。本研究结果显示，北京市顺义区2014⁃2015年诺如病毒的检出高峰分布在11月至次年3月，与以往报道基本相符。

在诺如病毒GI‐GVI 6个基因群中，本研究仅检出GI和GII两个主要引起人类急性胃肠炎的基因群，且GⅡ群较GⅠ群阳性检出率高，与之前报道相符［9］。

诺如病毒的基因变异速度很快，每隔几年便出现可引起暴发流行的基因变异株。1995年起，全球报道了多起GII.4型基因变异株引起的急性胃肠炎暴发流行，其中包括本研究选为参考株的1998年美国VA98387株［5］、2006年日本Kobe034株［6］和2009年美国New Orleans 1805株［7］。本研究结果显示，实验所得的11条GⅡ.4型RdRp区序列与这3株参考株的RdRp区序列不在同一个进化分枝上，且同源性差异较大，而与近年来引起诺如病毒暴发流行的2012年澳大利亚Sydney NSW0514株、2014年广州L106、L132和L295株在同一个进化分枝上，且同源性差异较小。这可能说明了诺如病毒的基因变异速度快，且实验株与参考株同源性差异的大小与它们的分离时间间隔有一定相关关系。

2014年冬季以来，全球报道的诺如病毒GII.17型新变异株引起的急性胃肠炎暴发疫情大幅增加，为更好的进行基因进化比对，我们选取了日本参考株Saitama5309株和Kawasaki323株［8］、韩国参考株CAU⁃267株［9］以及中国河北参考株wan 1、wan 4株［10］和上海142700株［11］，同时我们还选取2015年北京市顺义区参考株RdRp⁃290株。

本研究结果显示，实验所得的23条诺如病毒GⅡ.17型RdRp区序列与各GⅡ.17型参考株的RdRp区序列均位于同一进化分枝。虽然实验株与参考株的核苷酸同源性有所差异，但有氨基酸差异的只有14115和15017两株。该结果可能与诺如病毒GⅡ.17型新变异株的流行时间尚短有关。对于发生RdRp区氨基酸差异基因变异的GⅡ.17型诺如病毒是否同时发生了其他基因区氨基酸变异，及其是否会引起诺如病毒暴发流行还需进一步实验和监测。

本研究结果：2014年检出的诺如病毒GⅡ.4型居多而2015年GⅡ.17型居多，符合我国目前诺如病毒的流行趋势［2］。这可能也说明了诺如病毒GII.17型新变异株引起的急性胃肠炎进一步增多，其地位逐渐取代了先前流行的诺如病毒GII.4型基因变异株。

尽管诺如病毒感染导致的急性胃肠炎主要为自限性疾病，但仍有少数患者会发展为重症甚至死亡［18］。重症或死亡通常发生于高龄老人［19］和低龄儿童患者中［20］，健康成人感染后偶尔也会发展为重症，这说明诺如病毒的防控工作十分重要。我们通过对2014⁃2015年间北京市顺义区急性胃肠炎成年患者标本中诺如病毒的检测，了解了本地的诺如病毒流行情况、基因型别、系统进化关系以及同源性特征，为今后更好地监测诺如病毒打下基础。

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Characterization of Norovirus in adults with acute gastroenteritis in Shunyi district of Beijing from 2014 to 2015

Zhang Shuang，Jing Hongbo，Ma Hongmei，Jin Miao，Li Ying

Shunyi Center for Disease Control and Prevention，Beijing 101300，China（Zhang S，Jing HB，Ma HM，Li Y）；National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Jin M）

Zhang Shuang，Email：43761191＠qq．com

ObjectiveTo investigate the infection and genetic characteristics of Norovirus in adults with acute gastroenteritis in Shunyi District of Beijing.MethodsFrom January 2014 to December 2015，stool specimens and clinical data were collected from 240 adults with acute gastroenteritis from enteric clinics in Shunyi District of Beijing.Norovirus was detected by Real⁃time PCR in those specimens.For norovirus⁃positive samples，reverse transcription⁃PCR（RT⁃PCR）was performed to amplify RNA⁃dependent RNA polymerase（RdRp）gene fragment.The RdRp regions of norovirus⁃positive samples were sequenced and performed genotype analysis.ResultsThe positive rate of norovirus was 23.33%（56／240）out of 240 specimens collected.GⅡgroup was the predominant genogroup（20.83%，50／240），followed by GⅠgroup（2.50%，6／240）.There was no significant difference in the norovirus positive rate between male and female（χ2＝0.21，P＝0.65）.Norovirus could be detected throughout the year，and the prevalent peak was between November and March of the following year，from 2014 to 2015.The sequence analysis of RdRp regions showed that GⅡ.4（37.50%，6／16）was the predominant epidemic genotype of norovirus during 2014，and GⅡ.17（71.43%，20／28）became the predominant one during 2015.The 11 GⅡ.4 sequences of RdRp region obtained in this experiment and the GⅡ.4 reference strains which were isolated before 2009were not in the same phylogenetic branch，but the GⅡ.4 experiment sequences and the reference strains which were isolated in recent years such as Sydney NSW0514 strain were in the same phylogenetic branch. The gene homologies of the GⅡ.4 experiment sequences and the older reference strains were more different than the experiment sequences and the younger reference strains.The 23 GⅡ.17 sequences of RdRp region obtained in this experiment were in the same phylogenetic branch with all the GⅡ.17 reference strains selected.There were some nucleotide differences between the experiment sequences and the GⅡ.17 reference strains.All the experiment sequences have no amino acid differences with all the GⅡ.17 reference strains except 14115 and 15017.ConclusionsThe predominant epidemic genotype of norovirus was GⅡ.4 during 2014，which turned to GⅡ.17 during 2015 in adults with acute gastroenteritis in Shunyi District of Beijing.There were more than one norovirus genotype co⁃epidemic in Shunyi from 2014 to 2015.

Norovirus；Acute gastroenteritis；Genotype

张爽，Email：43761191＠qq.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

诺如病毒；急性胃肠炎；基因型

国家“十二五”科技重大专项（2012ZX10004215）；卫生行业专项（201302004）

2016⁃07⁃29）