组织工程医疗产品质量控制的关键技术要求和标准

王春仁　冯晓明　韩倩倩　中国食品药品检定研究院　（北京　100050）

组织工程医疗产品质量控制的关键技术要求和标准

王春仁冯晓明韩倩倩中国食品药品检定研究院（北京100050）

内容提要： 我国组织工程医疗产品的研发迅速，已逐渐从实验室阶段进入临床研究阶段，有的产品已经实现产业化，如何控制组织工程医疗产品的安全性和有效性是实现产业化的关键。本文对组织工程医疗产品的种子细胞来源、细胞的质量控制、培养基、材料支架表征等质量控制的关键技术要求和标准进行了综述。

组织工程 组织工程医疗产品安全性有效性评价标准

0.前言

组织工程医疗产品（tissue engineered medical products，TEMPs）是指用组织工程技术和工艺制备的，用于修复、改善、再生组织或器官结构与功能的医用产品。组织工程医疗产品通常是复合产品，细胞及细胞类成分是TEMPs的重要组成部分，因此，细胞与TEMPs产品的质量和安全密切相关。我国TEMPs的研究发展迅速，已逐渐从实验室阶段开始进入临床研究阶段，因此，如何控制用于TEMPs产品生产的质量和安全，如何制定TEMPs的质量标准不仅对于保证TEMP产品的安全性具有重要意义，也可以促进我国TEMPs产品的健康发展，解决组织工程产品产业化的瓶颈问题。在国家科技项目的支持下，中国药品生物制品检定所组织我国组织工程方面的专家、管理人员和科研工作者起草了组织工程产品的质量和安全评价相关标准，其中12个标准已经报国家食品药品监督管理局批准发布实施。对于组织工程医疗产品的研究、开发和产业发展起到了促进和指导作用。

1.种子细胞的质量控制

生产过程中所使用的各种组份应提供来源、质量标准及其所进行的检测项目；应详细说明生产过程中所用的各种试剂，是人源还是动物来源，猪源材料是否进行了猪细小病毒检测，反刍动物来源是否在可能污染牛海绵状脑炎病毒，所用试剂是否获得了FDA的批准，如果所用试剂是研究级试剂，应提供其来源、安全性及性能资料。如无菌试验、内毒素、支原体，及外源因子检测结果，进行功能性分析、纯度检测，有害残留溶剂检测结果。如果这些试剂已知有或潜在有毒性，则需对工艺进行验证，确保在终产品中已无这些试剂残留。

对同种异体或自体细胞应说明细胞来源的组织及细胞类型；是否进行过体内动员及其所用的动员方法；细胞采集所用的具体方法；采集单位的名称及地址，供体筛查的内容、方法及结果以评价供体资质；对于自体供体，如果供体某种病原体检测为阳性，或未进行筛查，则需有记录可以说明在产品的生产过程中，组织培养方法是否会造成病毒或其他外源因子的增殖或传播而危及到其他人。对于同种异体，应进行病毒筛查，如HIV-I/II，HBV、HCV、HTLV-I/II、CMV、EBV的检测等，并记录所用试剂及检测方法。

如果在生产过程中使用了细胞系，则应记录细胞系历史、来源、分离、检定及主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）检定频率。主细胞包括：①外源因子污染的检测，如无菌试验、支原体检测、体内及体外法的外源病毒检测；②特殊病原体的检测，人源细胞应检测CMV、HIV-I/ II，HBV、HCV、HTLV-I/II、EBV，牛和/或猪外源因子，应均为阴性；③细胞鉴别或均一性检测，如细胞表型、基因型或其他标记；④细胞纯度检测；⑤细胞活性及细胞成熟性检测；⑥记录细胞培养条件，如所用培养基、试剂或组份及其检测报告；⑦记录细胞冻存、运输、复苏的内容，如细胞密度、冻存支数、冻存温度、细胞库位置；⑧多次传代后细胞遗传及表型稳定性及复苏后细胞存活率。工作细胞库包括：①细菌、真菌污染的检测；②支原体检测；③一定的鉴别试验。

对生产工艺应描述自体或同种异体细胞采集、加工方法及细胞培养条件，包括细胞采集体积、物理或酶消化步骤、所用细胞筛选或分离仪器，培养系统、在线检测；对于采用放射性照射的体细胞治疗产品，应提供细胞照射后仍具有其特性但无复制能力的数据，放射源的校正；应详细记录从细胞收集到最终收获间每一步的时间间隔，从细胞采集到最后收获间细胞保存的时间及条件，保持细胞稳定性的操作程序；应详细描述细胞收获的过程，细胞收获方法、洗涤条件及洗涤介质，如果要冻存，应说明冻存的条件及保存时限；应提供终产品的配方，应说明在最终制剂中是否添加生长因子或人血清白蛋白，并注明其来源、供货商、终浓度。提供终产品中细胞浓度、运输条件等相关数据。

2.细胞培养用培养基的要求

培养基及其添加成份为细胞体外培养提供生长所需的营养成份，也是引入外源因子而造成细胞污染的来源之一，从而也是影响细胞安全性的一个因素，因此，控制培养基的质量是减少细胞污染提供产品安全性的一个重要措施。对培养基的要求分为两个方面，即基础培养基及其所添加的各种成份。细胞、组织及器官的生长、维持用的所有培养基及试剂应尽可能采用可用于临床的培养基及试剂，至少应选择具有良好资质供应商购买，而且，尽可能选择非动物来源的或不含动物来源组份的培养基及试剂。

如果培养基中要添加人源成份，如各种细胞因子，应尽可能选择已获得国家批准的临床用产品。如果无法获得国家批准的临床用产品，则尽可能从符合GMP要求的供应商购买，同时应建立其质量标准并对其进行检测。人源材料还应检测包括人乙型肝炎病毒（HBV），人丙型肝炎病毒（HCV），人免疫缺陷病毒I/II型（HIVI/II）及梅毒螺旋体等病原微生物可能造成的污染。

如果培养基中必须添加动物源性成份，如动物源性激素或细胞因子等，则至少应充分证明这些培养基或试剂的制备过程采用了病毒灭活工艺，而且病毒灭活工艺经过了充分的验证具有有效的的灭活效果。

如果在细胞培养过程中必须使用动物来源的细胞、组织及其衍生物等生物活性材料，如作为饲养细胞，则这些成份应从特定的动物饲养单位获取。如从封闭的无病原体种群的动物获取，而且应对原种进行监测并定期进行病原微生物的检测。

关于血清及抗生素的使用，各个国家的要求稍有所不同。但从血清安全性的角度考虑，培养基中应避免使用任何血清。但如果有些细胞在培养过程中必须添加血清激活或诱导，如牛血清，则必须对每批牛血清进行外源因子的检测，应至少包括无菌、支原体及牛源性病毒检测，而且应验证生产过程不会造成牛源性病毒的扩增。而为保证细胞的稳定性，特别是长期培养细胞的稳定性，并能及时发现生产环境及生产过程中可能造成的污染，用于生产的培养基中应尽可能不使用抗生素。

3.材料和支架的要求

为满足组织工程产品预期设计的性能达到要求，在产品设计时应考虑以下要点：材料及支架的生物相容性应符合GB/T16886系列标准的要求；材料及支架的物理、力学和化学特性应根据预期用途的性能要求选择合适的材料，并考虑制造、处理、灭菌和贮存对材料的影响。当药物作为组织工程医疗产品的组成部分时，对其应按照药品法规进行评价。作为组成部分的药物的原有性能不应受组织工程医疗产品的影响，反之亦然。

组织工程医疗产品使用的材料，包括遗传工程生产的生物材料，应在植入状态时具有可接受的生物相容性。根据GB/T16886.1的原则进行评价或从在相似的临床应用中已证实的合适材料中选择。评价的主要指标有细胞毒性、致敏试验、皮内刺激试验、全身毒性试验、血液相容性试验、遗传毒性、植入试验、致癌试验、生殖与发育毒性和生物降解试验。

应对支架材料的以下指标进行表征：降解特性；孔隙率和孔隙大小；形态结构；细胞粘附；化学成分；分子量；灭菌适宜性；力学特性；储存条件和时间。

制造过程中如果使用其他辅助材料，应对加工过程中使用的其他辅助材料和设备的质量进行适宜性评价。

对动物或人体来源的材料可能的传染性因子传播带来的危险性进行评价，包括非细菌和非病毒性因子。生物源性材料还应进行免疫源性评价。

用于组织工程的可降解生物医用材料有两大类：一类是来源于动物和植物组织的天然生物材料，主要有胶原蛋白、糖氨聚糖、壳聚糖、海藻酸盐、纤维蛋白等。天然材料通常具有良好的生物相容性，并且具有一定的生物活性和细胞外基质的作用，适合细胞的生长和分化的要求。这些材料可以在生物体内酶的作用下将其降解，其降解产物常是体内存在的物质对人体没有毒性，缺陷是天然材料的力学强度有时不能满足要求。有的可能存在传染性疾病的风险，有的还具有一定的免疫原性问题；另一类可降解材料是合成的生物材料，主要有聚α-羟基酸包括聚乳酸、聚羟基乙酸、聚ε-已内酯聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸等。这些材料在含有水的人体内环境中能被生物酶水解分解，高分子主链断裂，分子量逐渐减少，最终成为单体或分解成水和二氧化碳。合成材料也有较好的生物相容性，但在支持细胞粘附和生长方面不及天然材料，合成材料没有抗原性和传染疾病的风险，其力学强度可以根据需要合成。

天然材料和合成材料各有优缺点，因此在实际使用时常采用天然材料和合成材料的复合型材料，以满足组织工程支架各个方面的要求。在组织工程中除考虑材料的化学性质和物理特性外，还应该考虑支架的结构，如空隙状态、大小、连通性、空隙率、力学强度等。支架的这些要求对于细胞的粘附和生长，以及细胞所需营养物质的传递和代谢产物的交换是很重要的。一般要求组织工程支架的空隙率在80%以上，孔径在100～500μm，空隙之间应有良好的贯通性。

4.组织工程医疗产品标准

已有12个组织工程相关的质量和安全评价标准经国家食品药品监督管理局批准发布实施：（1）YY0606.3-2007组织工程医疗产品通用分类指南，标准规定了组织工程产品的各个方面，包括：组织工程的定义和范围、产品分类、组成成分、产品表征、评价分析、微生物安全以及传染性物质的要求以及检测方法。（2）YY0606.4-2007组织工程皮肤产品分类指南，标准规定了用来治疗皮肤损伤，替代恢复皮肤成分和功能的组织工程产品和材料的术语和分类标准。（3）YY0606.5-2007组织工程医疗产品用基质材料和支架表征和测试指南，标准规定了组织工程医疗产品用基质材料和支架的理化性能的技术要求。（4）YY0606.12-2007用于组织工程医疗产品的细胞、组织及器官加工处理指南，本标准主要规定了用于组织工程医疗产品的细胞、组织和器官的加工处理、检定生产以及质量保证。（5）YY0606.9-2007组织工程医疗产品用透明质酸钠，标准规定了组织工程产品的支架材料的原材料之一透明质酸钠的质量标准。标准对材料的理化性能和生物性能作出了规定，达到医用级水平，满足组织工程产品生产的需要。（6）YY0606.8-2008组织工程医疗产品用海藻酸钠，标准规定了组织工程产品的支架材料的原材料之一海藻酸钠的质量标准。标准对材料的理化性能和生物性能作出了规定，达到医用级水平，满足组织工程产品生产的需要。（7）YY0606.10-2008骨诱导材料评价指南，标准规定脱钙同种异体骨体内诱导骨形成的试验方法。（8）YY0606.13-2008细胞自动计数指南，标准规定组织工程用细胞的自动计数的方法。（9）YY/ T0606.14-2014组织工程医疗产品第14部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法-ELISA法。（10）YY/T0606.15-2014组织工程医疗产品第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法-淋巴细胞增殖试验。（11）YY/T0606.20-2014组织工程医疗产品第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法-细胞迁移试验。（12）YY/ T0606.25-2014组织工程医疗产品第25部分：动物源生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法。

风险管理也是医疗器械安全性保障的重要组成部分，企业应建立和保持与组织工程医疗产品有关的危害、识别和评价相关的风险，控制这些风险并监视控制有效性的过程。这个过程应形成文件并包括下列要素：风险识别；风险分析；风险控制和生产后的信息。风险管理按照医疗器械行业标准《YY/T0316-2003（ISO14971：2000）医疗器械风险管理对医疗器械的应用》的规定进行。

［1］ FDA， Guidance for Reviewers ，Instructions and Template for Chemistry， Manufacturing，and Control（CMC） Reviewers of Human Somatic Cell Therapy Investigational new Drug Applications（INDs），2003.

［2］ USA， Federal Register ，Part II， 21 CFR Part 210， 211， 820， and 1271， Eligibility Determination for Donors of Human Cells， Tissues，and Cellular and Tissue-Based Products； Final Rule and Notice.

［3］ ASTM F2210-02 Standard guide for processing cells，tissues，and organs for use in tissue engineered medical products.

［4］ 王军志:《生物技术药物研究开发和质量控制》（第二版），科学出版社，2007.

［5］ European Pharmacopeia-Method 5.2.3-Cell substrates for the production of vaccines for human use.

［6］ WHO - Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks 2010.

［7］ FDA Guidance for Industry-Characterization and Qualification of Cell Substrates and other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications 2010

［8］ FDA Guidance-Potency Tests for Cellular and Gene Therapy 2011.

［9］ FDA Guidance for Industry-Current Good Tissue Practice （CGTP） and Additional Requirements for Manufactures of Human Cells，Tissues， and Cellular and Tissue-Based Products （HCT/Ps）.

［10］ 国家卫生计生委，食品药品监管总局: 干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行），2015

The Key Technical Requirement and Standard of Tissue Engineered Medical Products

WANG ChunrenFENG XiaomingHAN QianqianNational Institutes of Food and Drug Control（Beijing100050）

The progress has been made rapidly in the tissue engineering research and development in China. So the tissue engineered medical products （TEMPs） begin from the laboratory bench move into market since some products realize the commercialization. The most important point is how to control the safety and effectiveness of the TEMPs. In this paper we propose some principle for the quality control of TEMPs associated with seeding cell resource， cell quality control， culture medium， raw material and scaffold characterization and standard etc.

tissue engineering， tissue engineered medical products， safety， effectiveness， evaluation， standard

1006-6586（2016）10-0001-04

R318

A

2016-06-08

王春仁，医学博士，研究员，中国食品药品检定研究院生物材料与组织工程室主任。从事生物材料、无菌医疗器械，外科敷料、介入器械、植入器械、人工脏器、体外诊断试剂和组织工程方面的研究和检测工作。