肢体缺血预处理的研究进展

王　芳　袁　强　孙晓彩

(河北医科大学病理生理学教研室，河北　石家庄　050017)

肢体缺血预处理的研究进展

王芳袁强孙晓彩

(河北医科大学病理生理学教研室，河北石家庄050017)

〔关键词〕肢体缺血预处理；缺血再灌注损伤；脑缺血耐受

缺血性脑病严重威胁着人类的生命健康，具有高发病率、高死亡率及高致残率等特点。传统的方法有改善血流状态、药物治疗、手术介入及中医中药等。然而，即使缺血后恢复了血液供应，受损的神经元也难以再生，给患者带来了严重的后遗症。如何提高神经元对缺血性损害的抵抗能力，使其在蒙受较严重的缺血时减轻损伤、保持存活，以保证恢复血液供应后这些神经元仍具有正常的功能，是医务人员面临的严峻问题。

1肢体缺血预处理(LIP)的提出

1990年，日本科学家Kitagawa等〔1〕首先发现了脑缺血耐受现象，即预先给予轻微、短时、不至于引起神经元损伤的脑缺血，可以保护神经元，使其能够耐受其后的通常会引起神经元损伤的较严重的脑缺血；预先给予的轻微、短时的脑缺血称为LIP。这表明LIP可以减轻脑缺血所造成的缺血再灌注损伤。尽管LIP诱导脑缺血耐受是一种强大的内源性保护，然而对中枢器官进行缺血预处理，很难作为一种预防措施直接应用于临床。Zhao等〔2〕研究证实，反复3次股动脉夹闭和再灌注的LIP可减轻随后即刻发生的脑缺血再灌注损伤，发挥了脑保护作用。这种对非重要生命器官的缺血预处理具有较好的可操作性和易接受性，临床应用前景良好。

2LIP在一些器官的保护作用

2.1心脏Lim等〔3〕在冠状动脉缺血再灌注模型中证实，提前阻断小鼠左侧股动脉5 min、再灌注5 min，反复3次后，心肌梗死面积较未做处理组明显减少，提示LIP对随后的心脏缺血性损伤具有保护作用，另外远程缺血预处理的抗心肌缺血作用在包括人类在内的不同物种中得到了证实。在临床实验观察中，Manchurov等〔4〕第一次证明了在经皮冠状动脉介入治疗术前进行远端缺血预处理后能明显改变急性心肌梗死患者的血管内皮细胞的功能，并且这种保护作用至少持续1 w。在进一步关于LIP心脏保护机制的实验中，研究者发现，体液循环介质发挥了关键作用，并确定了载脂蛋白C、结合珠蛋白α、甲状腺素运载蛋白单体形式、甲状腺素运载蛋白二聚体形式、血红蛋白β、载脂蛋白A-IV和纤维蛋白原β等七种调节蛋白的保护作用〔5〕。

2.2脑在LIP脑保护作用的研究中，文雅惠等〔6〕通过观察动物的神经功能及组织学损害后证实，LIP可明显减轻脑缺血引起的神经功能缺损及组织学损害，从而诱导脑缺血耐受，在此过程中，血管内皮生长因子(VEGF)和血小板源生长因子-B(PDGF-B)的表达明显增加，提示LIP可通过上调VEGF和PDGF-B的表达发挥脑保护作用，血管新生包括内皮细胞增殖和血管壁形成，VEGF是与血管新生关系最为密切的生长因子，PDGF-B在血管壁形成过程中有重要作用，因此血管形成可能在脑保护中也发挥了重要作用。另有研究指出〔7〕，LIP的这种脑保护作用可能是通过下调IL-7实现抗感染作用、抑制海马锥体细胞的凋亡以及激活腺苷AL受体而实现。

2.3肺临床上一些疾病，如器官移植、外伤及外科手术等均可引起器官缺血，当恢复血流供应后可能会造成缺血再灌注损伤，而肺脏是最易受损的器官之一。资料显示，大鼠肢体缺血再灌注后肺组织MPO活性增加、W/D及CD18阳性细胞数目增多、细胞间黏附分子(ICAM)-1表达上调，而实验中给予LIP可以通过抑制上述变化，实现对肺脏的保护作用〔8〕。

2.4肝脏有关研究指出〔9〕，LIP可以对抗大鼠肝脏的缺血再灌注损伤，可能与其抑制肝脏的炎性反应以及改善肝脏的微循环有关。也有学者发现在预处理的后期，LIP可以通过抑制细胞丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和C-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化而减轻家兔肝脏的缺血再灌注损伤〔10，11〕。

3LIP脑保护作用的研究

近年来，我室致力于大鼠四血管闭塞全脑缺血耐受模型的研究，发现反复3次股动脉夹闭和开放的LIP可减轻随后即刻发生的脑缺血再灌注损伤，降低海马CA1区锥体神经元迟发性死亡和凋亡，从而发挥脑保护作用，其机制尚未完全明确，涉及多信号通路。

3.1内源性NO参与LIP诱导的脑缺血耐受NO是以L-精氨酸为前体物质，在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下合成的一种气体型信号分子。研究发现，LIP后大鼠海马CA1区及血浆中NO及NOS活性增高，而在LIP前腹腔注射NOS的抑制剂L-NAME可明显阻断LIP的神经保护作用〔2〕。提示NO可能与LIP诱导的大鼠海马CA1区锥体细胞的缺血耐受性有关。

3.2丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通道参与LIP诱导的脑缺血耐受

3.2.1p38 MAPK通路p38 MAPK信号传导通路是MAPK家族中的分支之一，它通过磷酸化改变基因的表达水平，参与细胞内的信息传递，能对多数的细胞外刺激作出反应，介导细胞的生长、发育、分化及死亡的全过程。Sun等〔11〕研究证实，LIP上调大鼠海马CA1区、CA3区和齿状回区p-p38 MAPK的表达，提示LIP可能通过上调p38 MAPK的表达发挥脑保护作用。为进一步确定p38 MAPK在LIP诱导的脑缺血耐受的作用，LIP前侧脑室注射p38 MAPK特异性抑制剂SB 203580抑制p38 MAPK的功能，或是LIP前侧脑室注射p38 MAPK反义寡聚脱氧核苷酸(As-ODN)抑制p38 MAPK的表达，研究进一步证实了p38 MAPK表达上调参与了LIP诱导的脑缺血耐受〔12〕。

在进一步的研究中，探讨了LIP脑保护作用中p38 MAPK可能的下游机制：(1)超氧化物歧化酶(SOD)。LIP显著抑制了脑缺血引起的海马CA1区SOD活性下降、MDA含量的增加，而预先给予SB 203580可明显阻断LIP的上述保护作用，提示SOD作为p38 MAPK的下游分子在脑缺血耐受的诱导中发挥了重要作用〔13〕。(2)HSP 70。HSP 70是一种内源性保护蛋白，通常认为HSP 70可提高细胞对各种损伤因子的耐受性，在保护细胞结构和功能上起到重要作用〔14〕。

3.2.2细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通路2006年，Jin等〔15〕应用Western印迹和流式细胞技术观察了LIP后及在LIP前给予ERK特异性抑制剂PD 98059后p-ERK1/2的表达情况。结果显示，LIP后大鼠海马各区p-ERK1/2的表达均明显增多，只是时间不同步，在海马CA1区p-ERK1/2于LIP后6 h 表达开始增加，12 h 达到峰值，随后表达量逐渐下降，5 d 时回降至对照组水平；而在CA3区和DG区p-ERK1/2的表达在LIP后1 d 开始增加、3 d达到峰值，随后表达量下降，但是至5 d 时表达量仍高于对照组水平。LIP前右侧脑室注射ERK特异性抑制剂PD 98059明显阻断了LIP的神经保护作用，并呈现出剂量依赖性。上述研究结果表明，LIP通过上调海马ERK的表达对抗脑缺血后神经元的延迟性死亡。

3.3脑红蛋白(Ngb)和线粒体参与LIP诱导的脑缺血耐受脑Ngb是新近发现的神经系统中特异的携氧球蛋白，与脑内供氧密切相关，其主要以单体形式存在，含有151个氨基酸单链，分子量为17 kD。Ngb mRNA阳性细胞广泛分布于脑皮质，尤以颞叶听区、扣带皮质、梨状皮质较为密集。阳性细胞主要是锥体细胞。Ngb对氧有很高的亲和力，能够可逆地结合氧，其能力高于血红蛋白的携氧能力。Li等〔16〕研究证实，LIP能明显上调脑缺血模型中大鼠海马CA1区Ngb mRNA和蛋白的表达，同时可减少锥体神经元迟发性死亡，侧脑室注射Ngb AS-ODNs能阻断LIP的脑保护作用，而腹腔注射Ngb的诱导剂Hemin能模拟LIP的脑保护作用。此外，LIP有效增加了线粒体膜电位，增强线粒体Na+-K+-ATP酶活性、使线粒体超微结构在脑缺血中得到了保护，并且LIP的此种保护效应能部分被Ngb AS-ODNs所抑制或被Hemin所模拟。

3.4LIP通过抑制神经元凋亡和减轻脑水肿诱导脑缺血耐受我室通过四血管闭塞全脑缺血动物模型，发现全脑缺血前给予LIP保护的大鼠，与全脑缺血组相比凋亡的神经元数量明显降低，脑组织含水量明显减少，而LIP前侧脑室注射p38 MAPK拮抗剂SB 203580后，可阻断上述保护作用，说明LIP可以减轻脑缺血过程中的神经元凋亡和脑水肿，从而发挥了脑保护作用，并且这种保护作用与p38 MAPK相关〔17〕。

4LIP诱导脑缺血耐受机制中存在的问题

虽然在LIP诱导脑缺血耐受的研究中做了大量的研究工作，观察并发现了许多信号分子在其中的作用。但是，缺血预处理的肢体与遭受缺血打击的大脑之间相隔较远，由LIP启动的保护性信号是通过何种途径作用于脑的机制尚不完全清楚。

我室既往研究〔18〕发现，在LIP前切断双侧股神经可阻断LIP对脑缺血的保护作用，提示神经途径参与LIP诱导的脑缺血耐受。其可能途径为LIP再灌注期间释放介质激活传入神经纤维，并传至神经中枢的相关部位，再经传出途径后作用于脑内，激活脑内c-Fos等基因的表达，进一步诱导相关保护性基因的转录表达，达到对脑缺血的保护作用。国外学者研究指出，远程双下肢亚致死性缺血预处理可诱导24 h内的脑缺血耐受，这种保护作用在一定程度上可能是通过神经源性途径介导的〔19〕。此观点认为远端器官进行缺血预处理后，能激活局部的神经通路，并传到神经中枢，再通过传出神经作用到相应的靶器官，发挥保护作用。

在脊髓的缺血再灌注损伤模型中，双侧股动脉缺血10 min、再灌注10 min、循环2次的LIP能减轻家兔脊髓的缺血性损伤，于LIP前静脉内给予自由基清除剂二甲基硫脲(DMTU)能阻断LIP的脊髓保护作用，而LIP前静脉内给予神经节阻滞剂胺基己糖(HEX)却对LIP的脊髓保护作用无明显影响。上述结果提示LIP通过体液机制、而非神经机制诱导了脊髓的缺血耐受〔20〕。此种观点认为远端器官进行缺血预处理后能产生一些物质，这些物质通过血流到达靶器官处，激活相应受体并与之结合，启动了多种细胞内保护性信号，发挥对靶器官的保护作用。

此外，Lim等〔3〕在小鼠下肢LIP后心肌缺血模型中观察到，阻断股静脉血流后，预处理的保护作用就会被消除，同时联合切断股神经和坐骨神经后，得到同样的消除效果，但是分别阻断股神经和坐骨神经后仅仅部分消除了预处理的保护作用，说明下肢LIP是有神经和体液两个通路共同完成保护作用，从而减少小鼠缺血心肌的梗死面积。

据此推测LIP也可能是通过神经和(或)体液途径发挥了脑保护作用，在以后的实验中将进一步探讨。

5小结与展望

有关LIP脑保护作用的机制尚未完全明确，仍需要大量的基础研究与临床实践。但是，不可否认的是LIP为缺血性脑疾病提供了诊疗新思路，并且这种无创伤性的LIP具有易操作性、高安全性及患者易于接受等优点，对临床实践具有重要的指导意义。如果能进一步明确LIP脑保护作用的机制，医务工作者可以通过人工干预方式模拟其脑保护作用、减轻脑损伤，将其真正应用于临床，为患者带来切实可行的保护。

6参考文献

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3Lim SY，Yellon DM，Hausenloy DJ.The neural and humoral pathways in remote limb ischemic preconditioning〔J〕.Basic Res Cardiol，2010；105(5)：651-5.

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〔2015-10-11修回〕

(编辑袁左鸣)

基金项目：国家自然科学基金(No.31100781)；河北省自然科学基金(No.C2011206040)；河北省高等学校科学技术研究重点项目(No.ZD2010135)；河北省卫生厅资助项目(No.20090313)

通讯作者：孙晓彩(1976-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事缺血性脑病的研究。

〔中图分类号〕R363

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2793-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.108

第一作者：王芳(1988-)，女，硕士，主要从事神经病理生理学研究。