靶向基因修饰技术在免疫缺陷动物模型研究中的应用进展

信吉阁，曾养志

(1. 云南省版纳微型猪近交系重点实验室,云南 昆明 65020；2.云南农业大学动物科学技术学院,云南 昆明 650201)



靶向基因修饰技术在免疫缺陷动物模型研究中的应用进展

信吉阁1,2，曾养志1*

(1. 云南省版纳微型猪近交系重点实验室,云南 昆明 65020；2.云南农业大学动物科学技术学院,云南 昆明 650201)

免疫缺陷动物模型在人类相关疾病机理研究、药物研发、器官移植研究和干细胞研究中有重要的应用。但由于传统基因修饰动物构建技术难度大、效率低等限制，在中型、大型动物中获得的免疫缺陷动物模型还很少。近年来新兴的靶向基因修饰技术，包括ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等，为高效率免疫缺陷动物模型构建提供了技术基础。本文就ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9的技术原理及研究进展进行概况介绍，并详细地阐述这些技术在中型和大型动物中免疫缺陷动物模型构建方面取得的进展，包括KORag1/Rag2兔、KORag1/Rag2猪、KOIL2rg猪、KOPpar-/Rag1猴等。这些免疫缺陷动物模型不仅能用于人类SCID相关疾病研究，评价干细胞移植的效率和安全性，且可进行临床前手术治疗研究，生产人源化动物模型等，进而架起实验动物与医学应用的桥梁，促进临床前细胞再生策略的综合评价体系的发展。

免疫缺陷；动物模型；靶向基因修饰技术；Rag基因；IL2rg基因

实验动物和动物模型常被称为人类替难者，科研活试剂，利用动物实验开展的与人类相关的基础研究，已在医学各个领域做出了许多创造性、里程碑式的科研成果。而免疫缺陷动物是指由于先天性遗传突变或人工方法造成免疫系统某种或多种成分缺陷的动物，是一种进行生物医学研究的重要工具。从先天性无胸腺的裸鼠(nude mouse)、严重联合免疫缺陷症(severe combined immunodeficient disease，SCID)小鼠的发现，到移植了人免疫组织或免疫细胞使之具有人类部分免疫系统的SCID-hu小鼠，利用这些免疫缺陷动物模型，已在细胞水平和分子水平阐明了造血系统和免疫系统的发生和调节的关键问题，而且在病毒学、免疫学、血液病学等研究领域有广泛的应用。此外还在犬[1, 2]、猪[3, 4]、马[2, 5]等大型哺乳动物中发现的先天性自发的免疫缺陷动物。但先天性的免疫缺陷动物数量和类型少，且不能人为控制。

转基因修饰技术和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)的发展和完善，为生产免疫缺陷动物模型的构建开辟了崭新的途径。常用的基因修饰技术有逆转录病毒载体法、原核显微注射、精子载体法、SCNT及胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)法等。每种方法都存在一定的优劣势。其中原核显微注射技术被认为是生产转基因动物最可靠的方法，特别是在小鼠中，这一技术得到了广泛的应用，但易产生嵌合体，且需要在获得大量的动物个体基础上再进行转基因整合和表达的筛选。尽管基于完善的ES系统和胚胎重建技术，小鼠基因敲除操作技术得以较广泛地应用。如已获得多种与免疫缺陷相关的基因修饰鼠[6-9]。但大多数动物尚未建立完善的ES系统，科学研究者在大动物ES建系方面虽然做了很多努力，但都没有能够得到生殖系嵌合ES。由于缺少真正的ES，大动物的基因打靶难以实现，利用传统方法获得基因敲除动物的报道很少。

1 新兴的靶向基因敲除技术

近年来新兴了多种基因高效靶向修饰和调控技术，包括锌指核酸酶技术(zinc finger nucleases，ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶技术(transcription activator-like effector nuclease，TALENs)及CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated 9)技术等。这些技术提高了基因敲除的效率和特异性，不仅为研究基因功能开辟了新的途径，也能有助于大动物免疫缺陷模型构建研究，进而促进生物学、医学等相关领域的研究的发展。

1.1 ZFNs

ZFNs技术的核心设计原则是将特异性识别模块和功能模块这两种有特定功能的结构域融合，形成具有特定功能的蛋白[10]。3-6个Cys2-His2锌指蛋白重复单位构成单个ZFN的DNA结合结构域，其功能是特异性识别1个三联体碱基；FokI的C端的96个氨基酸残基组成单个ZFN的DNA剪切域，具有非特异性核酸内切酶功能。一个锌指蛋白组与一个FokI单体相连组成一个ZFN，识别特定的基因靶位点，当两个靶位距离为6-8 bp时，两个单体ZFN相互作用而产生酶切功能[11]。在这特异位点产生1个DNA双链切口(double strand breaks，DSB)，然后利用细胞固有的(homologous recombination，HR)或非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)这两种修复机制进行切口修复。HR途径可使基因组DNA得到完全的修复，或是在DSB位置发生基因交换，而NHEJ途径可基因组DNA会产生插入碱基或者缺失碱基，可能会产生移码突变，进而导致基因功能丧失[12, 13]。

利用ZFNs技术在特定基因位点产生的DSB，研究者近年来已经在植物、线虫、果蝇、两栖类、人体细胞等多物种中进行高效率的基因定点修饰[14]。2009年ZFNs在啮齿类哺乳动物中应用成功，获得了基因打靶大鼠[15]。2011年Lai等[16]首次采用这一技术成功获得PPAR-γ基因打靶猪，这是世界上首次采用该技术在大型哺乳动物上实现内源基因的定点修饰，为缺少有效ES细胞的大动物的基因打靶提供了高效的技术路线。

1.2 TALENs技术

研究在植物细菌Xanthomonassp中发现了TAL蛋白氨基酸序列与核苷酸序列的对应关系，即其核酸结合域的氨基酸序列和其靶位点的核苷酸序列的确定关系，NI识别A、NG识别T、HD识别C、NN识别G。重复单元由34个氨基酸重复序列组成，其被称为重复可变双残基(repeat variable di-residue，RVD)的第12和13个氨基酸能对应识别特定碱基[17, 18]。利用TAL蛋白的特性，组成能特异结合碱基序列的模块蛋白，可以实现定点基因修饰。利用TAL的序列模块，可构建识别任意靶序列的重组核酸酶，如研究者将TALEs蛋白C末端的AD替换为FokI限制性内切酶，构建了具有较高效率的人工核酸酶TALENs[19]，实现在特异的位点切断靶基因，然后在该位点进行敲入，敲除或点突变操作。

TALENs与ZENs效率相似，但在基因序列选择，细胞、物种选择上具有优势。同时TALENs实验设计步骤更简单准确，实验所需成本低，脱靶现象少而产生的毒性低。TALENs技术可在植物、人类细胞、酵母、斑马鱼以及大、小鼠、爪蟾，家蚕等各物种上进行基因修饰操作[20]。Carlson等[21]利用构建的TALENs，在牛和猪上采用胚胎显微注射和筛选细胞克隆的方法尝试获得基因敲除家畜，成功地得到了Ldlr基因敲除猪。Lai等[22]采用体外转录TALENs mRNA向兔受精卵胞质内注射的方法，获得Rag1和Rag2基因敲除兔。Liu等[23]利用TALENs技术在恒河猴和猕猴上实现了基因敲除。TALENs基因打靶技术的研究和应用为高效率的基因打靶提供了技术基础，将推动转基因动物技术的发展。

1.3 CRISPR/Cas

CRISPR/Cas是研究者基于细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御系统改造而建立起来，研究者发现细菌被外来的噬菌体或病毒入侵时，能通过CRISPR，即被称为成簇的有规律间隔的短回文重复序列，或是与之相关Cas的序列在RNA的介导下剪切外来基因，达到抵御的作用[24]。研究人员设计单链引导RNA(single guide RNA，sgRNA)，能模拟crRNA和tracrRNA的结构特征且具备了crRNA-tracrRNA复合物的功能，即在sgRNA-Cas系统中sgRNA部分能与Cas9结合并定向识别DNA序列，而Cas9则具有核酸内切酶的活性[25]。

与ZFNs技术和TALENs技术相比较，CRISPR/Cas特点是制作过程简单、成本低廉、效率高[26]。Wang等[27]研究者用CRISPR/Cas9系统一步法获得了多基因突变的小鼠。利用CRISPR/Cas9已获得多种基因打靶动物，如大鼠[28]、小鼠[29]、猪[30]、猴[31]等。Whitworth等[32]报道通过CRISPR/Cas9系统获得CD163和CD1D基因敲除体细胞，然后进行SCNT获得了基因敲除猪。2014年10月Zou和本文作者等利用CRISPR/Cas9系统和改造后的Cas9-nickase系统，选择PARK2和PINK1及编码酪氨酸酶的TYR基因，进行基因敲除操作，通过对PFFs转染一对gRNA质粒和Cas9n质粒成功获得20头PARK2和PINK1双基因敲除和15头具有典型白化表型特征的TYR基因敲除猪模型[33]。

作为一个新兴的技术，CRISPR/Cas9目前存在最大的争议就是脱靶问题，相比于ZFNs技术和TALENs技术，因识别的靶位点序列短，CRISPR/Cas9系统似乎更容易出现脱靶问题。多项研究通过提高CRISPR/Cas9的特异性以减少脱靶现象的发生[34,35]。

2 新技术在免疫缺陷动物模型构建上的应用

ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9技术等多种基因高效靶向修饰和调控技术，已在多种动物上实现了基因修饰模型的构建，这里主要介绍在中型和大动物上已获得的与免疫缺陷相关的动物模型。这些工作主要集中在是对重排激活基因(recombination activating gene，Rag)基因和白介素2受体基因(interleukin-2 receptor gamma，IL2rg，或cCD132)基因敲除研究。RAG基因主要是负责T细胞和B细胞重排的重组激活基因，RAG1/2基因编码酶，能催化Ig和TCR基因V(D)J重排，在B和T淋巴细胞前体细胞产生多样性的B和T细胞初级免疫。Rag1/2基因是两个相邻的基因，位于常染色体，编码的酶是蛋白复合体协同地行使功能。两个基因中的任意一个打断，V(D)J重排不能完成，B和T细胞的发育停滞在不成熟阶段。Rag1/2基因功能在不同的哺乳动物物种里是保守的。在人类中，Rag1/2突变导致B和T细胞完全缺失，称为Omenn，不正常的T细胞没有足够的重排，能引起自体反应，病人症状与移植物抗宿主疾病相似。Rag1/2敲除小鼠免疫缺陷，特征是缺少成熟B、T细胞[6, 7]。IL2rg基因突变会严重阻碍B细胞，T细胞的发育和功能，完全阻碍了NK的发育，影响了淋巴结间叶原基的发育，继而淋巴结发育和组织不完全。哺乳动物IL2rg同源基因特异地位于X染色体，人类IL2rg突变将导致X染色体连锁重症联合免疫缺陷(X-linked severe combined immunodeficiency，XSCID)。T细胞、NK细胞缺失或数量极度减少，但B细胞数量上正常(或是增加)但功能丧失。IL2rg基因突变已发展了许多不同免疫缺陷小鼠品系[8]。

现对在兔、猪、猴这些中大型动物上已获得的免疫缺陷模型及相关研究进展简要介绍如下。

2.1 免疫缺陷兔模型

兔是一种重要的实验动物，对其某些遗传性状进行定向修饰，可大大地拓展家兔在生物医药研究领域的应用价值。但是，由于世界上还没有建立起具有生殖系嵌合能力的家兔胚胎干细胞系，兔的克隆效率又极低，获得基因敲除兔的难度极大。Song等[22]首次将TALENs技术应用于兔基因敲除研究，根据TALENs靶点设计原则，分别在Rag1和Rag2上设计一对TALENs，经体外转录后进行胞质注射，移植受体后分别获得了18和15个仔兔，突变率分别高达94.4%和93.3%，其中，Rag1有11只(61.1%)仔兔发生双敲，Rag2有7只(46.7%)仔兔产生双敲。该研究获得了世界首例免疫缺陷家兔疾病模型，并建立了兔基因打靶的高效技术平台。

兔是常用的实验动物，与小鼠相比，其生理结构、发病症状等都更接近于人类。且体型适中，适合进行反复活体监测、采样等操作；同时繁殖快、饲养成本低适合大样品量实验数据的收集。而且一些致病突变在兔上引起的症状和在人类上引起的症状非常相似。诱发和自发突变的兔品种构建多种疾病模型，包括动脉粥样硬化、肥厚性心肌疾病、糖尿病等[39, 40]。该研究获得的Rag基因敲除兔细胞和B细胞发育停滞，丧失了绝大部分的免疫功能等表型，将为生物医学研究包括人类相关疾病(如Omenn综合征)发病机制、药物开发、器官移植研究和干细胞研究提供了重要动物模型。

2.2 免疫缺陷猪模型

Huang等[36]分别针对猪的Rag1和Rag2的外显子设计了TALENs质粒对，对猪的胎儿成纤维细胞进行转染后获得杂合和纯合的Rag1/2敲除的细胞克隆。细胞克隆用于体细胞核移植后获得27头克隆猪，其中有10头为Rag2单等位碱基缺失，9头为Rag1双等位碱基缺失，3头为Rag2双等位碱基缺失，这些碱基缺失都导致了外显子读码框移码。Rag1/2双等位敲除猪表现出了典型的SCID特征，包括胸腺萎缩，脾脏发育不良，淋巴细胞减少，体细胞基因组V(D)J重排消失，无成熟的T、B细胞。由于猪在体型、寿命、生理指标，特别是免疫机制等与人类相近，该研究成功建立的Rag敲除的SCID小型猪模型有望在生物医药和转化医学中发挥重要作用。

Lee等[37]进行了移植人iPS细胞和同种异体猪细胞到Rag2基因敲除重症联合免疫缺陷猪的研究。利用TALENs系统，SCNT获得了Rag2基因敲除猪。双敲的猪或是缺失胸腺，或是发育不全。B、T细胞脾脏白髓缺失。在普通的饲养环境，在四周时与年龄相当野生型猪相比，Rag2基因敲除猪表现出生长发育迟缓，脾脏有炎症和细胞凋亡现象。饲养在干净的环境里会更健康，注射人的iPS细胞，很快形成畸胎瘤，具有3胚层。进行同种异体滋养层干细胞移植有耐受性。

Masaito等[38]研究者采用了一种操作简单且无外源基因整合的策略获得了IL2rg基因敲除猪，利用ZFN-编码mRNA转染猪胎儿成纤维细胞，获得基因敲除细胞后进行SCNT，共出生4头雄性IL2rg基因敲除猪。表型分析发现基因敲除猪完全缺失胸腺，T细胞，NK细胞几乎检测不到，B细胞数量正常，这些与人类X-连锁SCID疾病相似。

Shunichi等[41]利用同源重组和连续核移植的方法也获得了杂合子IL2rg+/-雌性猪和IL2rg基因敲除雌性猪和IL2rg-/Y的雄性猪，表型为无胸腺，免疫球蛋白显著受损，T细胞，NK细胞明显减少，与人类SCID症状相似。同种异体骨髓移植，供体细胞在IL2rg-/Y杂合子中稳定整合。

因猪生理学与人类更接近，与啮齿类模型相比，猪动物模型能高保真地复制一些人类疾病，尤其对一些免疫系统相关的疾病。SCID猪模型能为再生医学研究、异种器官移植、肿瘤发育提供有效的模型，有助于发展人类SCID疾病治疗策略，在移植生物学中也将有广泛的应用。

2.3 RAG1基因敲除猴

2014年2月Niu等[31]研究者首次获得了靶向基因编辑猴。猴是重要的动物模型，猴疾病模型能更好地模拟人类疾病，降低药物研究的风险，开发有效的治疗方案等。该研究利用CRISPR/Cas9系统，经胚胎细胞注射方法，同时对调节代谢的基因Ppar-γ，调节免疫功能的基因Rag1，调节干细胞和性别决定的基因这三个基因进行敲除，在对15个胚胎的基因组DNA 进行测序后，发现其中有8个胚胎显示出两个靶基Ppar-γ和Rag1同时突变。随后，将基因修饰过胚胎移植到代孕母猴体内，生出了一对孪生猴。检测这对孪生猴的基因组DNA证实的确存在Ppar-γ和Rag1基因突变。研究人员指出，婴儿猴目前仍太小，尚不能断定基因编辑是否会对其产生生理和行为学影响。3年后猴成年时，还需观察这些基因编辑对后代是否有影响。该研究首次成功获得了基因工程灵长类，证明了CRISPR/Cas9系统在猴基因敲除研究的有效性。

3 应用前景

干细胞在再生医学上有广泛应用前景，现已获得的人iPSCs，可能为个体移植治疗提供组织来源。但仍需考虑的问题是获得的iPS是否有潜在全能性，应用于移植治疗是否安全。因此研究者越来越认识到除了啮齿类，在许多生物医药应用上需要建立更多其他动物模型[42, 43]，用于器官和细胞移植方案的研究。而且，啮齿类小鼠和人类免疫系统功能和调节的各方面都有显著的不同[44]，不适用于模拟一些人类遗传疾病和感染疾病，且对于外科手术和临床监测操作来说，啮齿类体型过小[45]。研究者试图通过非人灵长类来弥合啮齿类和人类之间的空白。但存在苛刻的伦理道德限制，在欧洲禁止使用黑猩猩用于生物医学研究，美国NIH也在2011年下令停止黑猩猩用于开展新的研究。综合考虑猪是理想的免疫缺陷动物模型。在Lee等[37]研究中发现Rag2敲除猪和Rag2敲除鼠在表型上存在明显不同，敲除鼠有小的但可检测到的胸腺[7]，而猪则为完全没有胸腺或完全没有发育。在IL2rg基因敲除猪中也有相似的发现[38, 41]。IL2rg基因打靶小鼠尽管表现出免疫缺陷表型[46]，包括NK细胞活性消失，注射纯化的人类造血干细胞，可重构有功能的人类造血系统和免疫系统。但人的XSCID与IL2rg敲除小鼠存在表型上区别，IL2rg敲除小鼠B细胞减少，IL2rg敲除猪有B细胞，与人类XSCID表型更接近。利用新技术高效获得带有T-B-NK+SCID表型的Rag2突变猪，T-B+NK-IL2rg基因敲除猪，能作为人类SCID相关疾病的模型，评价干细胞移植的效率和安全性，进行临床前手术治疗研究，生产人源化猪。

近年来新兴的靶向基因敲除技术的出现，新技术突破了传统技术的低效性，且特异性极高，极大地促进了动物模型构建研究的发展，已在多个物种上成功实现基因定点修饰[47]。同时通过对小鼠等模式动物的基础研究，现在对多种严重的人类疾病的分子基础已经了解清楚，再利用近年来新兴的靶向基因敲除技术可以实现在兔、猪、猴等动物上复制遗传疾病候选基因的损伤。大动物在基础研究方面不太可能代替小鼠，但已经为平移研究提供强大的补充资源，架起实验室研究与医学应用的桥梁。当然，建立新的动物品系需要进行详细深入的特征描述，充分地在动物上模拟人类疾病特征。在中型和大动物上的获得免疫缺陷模型使临床前细胞再生策略的综合评价体系迈进了一大步。

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Research progress of immunodeficient animal models using gene modification techniques

XIN Ji-ge1,2, ZENG Yang-zhi1*

(1. Key Laboratory of Banna Minipig Inbred Line of Yunnan Province, Kunming 650201, China;2. Animal Science and Technology College, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201)

The established immunodeficient animal models could be used as valuable resource for mechanism research of related disease in humans, drug discovery and development, translational research and stem cell research. However, it is difficult and low-efficient to establish the genetic modified animal models using traditional technologies. The reports for immunodeficient animal models are few in middle-size and large animals. Recently, several effective gene-targeting tools, including ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9, develop quickly and provide technology basis for the establishment of immunodeficient animal models. In this paper, the technology principles and research progresses of ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9 are introduced. The significant progresses of these emerging technologies achieved in immunodeficient animal models are also elaborated, including KORag1/Rag2 rabbit, KORag1/Rag2 pig, KOIL2rgpig, KOPpar-/Rag1 monkey, and so on. In addition to being models for researching SCID-related diseases in humans, and evaluating the efficacy and safety of stem-cell engraftment, these models may be also useful to develop surgical procedures for placement of grafts before clinical trials in humans, to produce humanized animals and bridge the gap between laboratory animal and medicical research. The immunodeficient animal models described here represent a step toward the comprehensive evaluation of preclinical cellular regenerative strategies.

Immunodeficiency; Animal models; Gene-targeting technology; Gene modification techniquesRaggene;IL2rggene

ZENG Yang-zhi， E-mail: zengyangzhi@sina.com

国家自然科学基金项目(31360532)；云南省应用基础研究计划项目(2013FB041)；校博士科研启动基金项目(2002374)。

信吉阁，女，讲师，博士，研究方向：现代生物技术。E-mail： synlelovely@163.com

曾养志，男，教授，硕士生导师，研究方向：遗传学研究。E-mail： zengyangzhi@sina.com

研究进展

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0535-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.018

2016-04-18