Lewis大鼠下丘脑中肾阳虚相关mRNA表达及超微结构观察

张利棕，方明笋，杨伟吉，蔡月琴，徐剑钦，寿旗扬，陈民利

(浙江中医药大学，杭州 310053)



Lewis大鼠下丘脑中肾阳虚相关mRNA表达及超微结构观察

张利棕，方明笋，杨伟吉，蔡月琴，徐剑钦，寿旗扬*，陈民利

(浙江中医药大学，杭州 310053)

目的 通过对Lewis大鼠下丘脑肾阳虚相关基因表达和超微结构的观察，进一步对Lewis大鼠肾阳虚体质进行研究。方法 采用Lewis大鼠与皮下注射氢化可的松法的肾阳虚模型进行比较，并通过检测各组大鼠下丘脑中TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR mRNA表达和下丘脑、肾上腺组织超微结构的观察等,对Lewis大鼠肾阳虚体质机制进行研究。结果 与正常Wistar大鼠比较，Lewis组大鼠下丘脑GR、IL-2 mRNA表达明显升高(P<0.01)，而下丘脑CRH、TNF-α、IFN-γ、IL-10 mRNA表达明显降低(P<0.01)；Lewis大鼠肾上腺皮质束状带略变薄，线粒体减少，且有轻微变形肿胀；Lewis大鼠下丘脑神经元细胞体胞核大，核形不规则，线粒体明显减少，神经细胞突触减少，突触前部的分泌小泡减少。结论 Lewis大鼠下丘脑和肾上腺存在一定程度的超微结构改变，且免疫相关细胞因子和CRH mRNA的异常表达，这可能与其自身HPA轴的功能失衡有关。

Lewis大鼠；肾阳虚；mRNA表达；超微结构

中医认为，肾阳是人之根本，肾阳亏虚造成机体酸冷、夜尿增多、脉象无力、舌淡苔白等虚寒症候，即为肾阳虚证[1]。肾阳虚证动物模型是最早建立的中医证候动物模型之一。肾阳虚证涉及多系统和多器官的功能失衡，与神经内分泌免疫网络关系密切，诸多肾阳虚动物模型确有类似肾阳虚证的临床表现，但一定程度上有违肾阳虚患者下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pitultary-adrenal，HPA)轴功能减退、血浆皮质醇减少的病理改变，尚需从整体、微观以及基因分子水平等方面对肾阳虚证进行更加深入的研究。

Lewis大鼠作为一种实验性脑脊髓炎、类风湿关节炎等自身性免疫性疾病造模常用的实验动物，其自身存在HPA轴功能的缺陷[2-3]。前期我们通过对Lewis大鼠表观的一般体征、行为学和临床肾阳虚证相关指标(血清ACTH、CRH、Cort、尿液17OHCS)等的测定，发现Lewis大鼠可能具有先天性肾阳虚体质[4]。

为进一步探寻Lewis大鼠自发性肾阳虚的基因、分子及超微结构等方面的证据，从微观层次来解释Lewis大鼠所具有的肾阳虚症状。本研究拟用Lewis大鼠与皮下注射氢化可的松(HYD)肾阳虚大鼠模型进行比较，并通过对各组大鼠下丘脑中TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR mRNA表达和肾上腺、下丘脑组织超微结构的观察，为Lewis大鼠作为自发性肾阳虚体质模型提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级雄性Lewis大鼠10只，7～8周龄， 体重240～260 g，购自北京维通利华实验动物有限公司【SCXK(京)2012-0001】；SPF级雄性Wistar大鼠20只，7～8周龄，体重220～240 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCXK(沪)2012-0002】。本实验所有手术、操作均在浙江中医药大学动物实验研究中心的屏障手术室中进行【SYXK(浙)2013-0184】；所有涉及到实验动物的使用与操作均遵循3R原则。

1.1.2 试剂

氢化可的松注射液：天津金耀药业有限公司，批号：20130415，100 mg/20 mL(5 mg/mL)，5支/盒；戊巴比妥钠：德国进口分装，批号：WS20120112，规格：25 g/瓶，含量>99.0%；戊二醛：上海化学试剂采购供应五联化工厂，批号：20110415；丙酮：杭州化学试剂有限公司，批号：20120730； ERL-4221(脂环肪族环氧树脂)、DER(736聚二醇二缩水甘油醚树脂)、DMAE(二甲氨基酸乙醇，美国SPI公司)；四氧化锇(北京中镜科仪技术有限公司)。

1.1.3 仪器设备

MLS-3020高压灭菌锅(日本三洋公司)；AF100雪花状制冰机(美国Scotsman)；超低温冰箱(Thermo)；AG204-电子分析天平(瑞士Mettler)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad)；匀浆机(IKA)；冷冻高速离心机(Thermo)；微量核酸测定仪(Thermo)；生物安全柜(Thermo)；透射电镜(日本Hitachi H7650型)；超薄切片机(德国Leica)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组及样本取样

(1)Lewis组：取10只Lewis大鼠，不作任何干预，饲养于IVC中，自由采食饮水，连续3周。

(2)Wistar正常组：随机取10只Wistar大鼠，处理同Lewis组。

(3)Wistar-HYD组：随机取10只Wistar大鼠，每只大鼠以15 mg/(kg·d)的剂量连续3周皮下注射HYD，建立肾阳虚模型。

造模过程中一周2次对各组大鼠的体重、肛温、大便干湿程度、脱毛情况等体征指标进行测定和观察。一周1次对各组大鼠测定24 h代谢、饮食量、饮水量和尿量，并记录各项一般体征；处理动物前进行旷场实验和Morris水迷宫的行为学测定。造模完成后，各组大鼠麻醉后心脏抽血，断头取脑，在冰浴上分离出下丘脑，一部分装入冻存管后迅速置于液氮罐中；取小块肾上腺和下丘脑组织样本，置于装有2.5 %戊二醛的离心管中，用眼科剪剪碎至每粒约0.1 mm3大小。

1.2.2 下丘脑中TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR mRNA表达

以Trizol法提取5 μg各组大鼠下丘脑的总RNA，逆转录成cDNA，用SYBR Green嵌合荧光法进行实时PCR检测TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR基因表达。实时定量PCR引物见表1。

表1 实时定量PCR引物

操作步骤：①取100 mg左右的下丘脑，置于2 mL的PE管中，剪碎，加入1 mL RNAiso Plus，冰浴上匀浆后抽提RNA；②用分光光度计紫外吸收测定RNA浓度及检测其纯度，凝胶电泳对RNA纯度及完整性进行检测；③参考试剂盒说明书将样品RNA逆转录为cDNA；④将转录好的cDNA模板参考说明书加入到PCR反应混合液中，进行实时定量PCR反应。根据标准曲线结果计算目的基因和内参基因的平均CT值以及△CT值，进一步通过cDNA浓度梯度的log值对△CT值作图，所得直线斜率绝对值接近于0，说明目标基因和内参基因的扩增效率相同，就可以通过2-△△CT方法进行相对定量。

1.2.3 肾上腺和下丘脑组织超微结构的观察

将采集到的肾上腺和下丘脑组织样本，进行脱水，包埋，切片，透射电镜观察组织超微结构的变化。

操作步骤：① PBS漂洗(15 min×3次)；② 锇酸固定(1～2 h)；③ PBS漂洗(15 min×3次)；④ 脱水；⑤ 纯酒精脱水3次，每次15 min；⑥ 纯丙酮脱水3次，每次15 min；⑦ 包埋剂渗透:丙酮与包埋剂1∶1配置溶液渗透1 h；丙酮与包埋剂1∶3配置溶液渗透3 h；⑧ 包埋及70 ℃聚合；⑨ 取出聚合完成的样品切片。

1.2.4 数据处理

2 结果

2.1 各组大鼠下丘脑中CRH、GR、MR mRNA的变化

由表2结果可见，与Wistar正常组比较， Lewis组大鼠下丘脑GR mRNA表达明显升高(P<0.01)，而下丘脑CRH mRNA表达明显降低(P<0.01)；Wistar-HYD组大鼠下丘脑CRH、GR、MR mRNA表达明显升高(P<0.01)；说明未经干预的Lewis组大鼠自身存在CRH基因表达低水平的现象。

表2 各组大鼠CRH、GR、MR mRNA的变化

注：与Wistar正常组比较，**P<0.01。

Note. Compared with the Wistar normal group,**P<0.01.

2.2 各组大鼠下丘脑中TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10 mRNA的变化

由表3结果可见，与Wistar正常组比较， Lewis组大鼠下丘脑TNF-α、IFN-γ、IL-10 mRNA表达明显降低(P<0.01)，而下丘脑IL-2 mRNA表达明显升高(P<0.01)；Wistar-HYD组大鼠下丘脑TNF-α、IFN-γ mRNA表达明显升高(P<0.01)。

2.3 肾上腺和下丘脑组织超微结构的观察

由图1结果可见，电镜下观察可见，Wistar正常组大鼠肾上腺皮质细胞呈规则多边形，且成束排列，胞核呈圆形，较少异染色质，胞内存在大量形态规整的线粒体和较多的大而圆的脂滴。Lewis组大鼠肾上腺皮质束状带略变薄，线粒体减少，且有轻微变形肿胀。Wistar-HYD组大鼠肾上腺皮质细胞排列的束状带变薄，细胞萎缩变小，细胞核质比变大，胞核异染色质增多，线粒体减少，且有明显的变形肿胀，脂滴颗变小，并常见其中有高电子密度的物质。

由图2结果可见，Wistar正常组大鼠下丘脑细胞核圆整，细胞器结构正常丰富，突触膜结构清晰。Lewis组大鼠下丘脑神经元细胞体胞核大，核形不规则，线粒体明显减少，神经细胞突触减少，突触前部的分泌小泡减少。Wistar-HYD组大鼠模型组下丘脑神经元细胞体胞核大，核基质变淡并出现空泡，核形轻微不规则，线粒体减少。

表3 各组大鼠TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10 mRNA的变化

注：与Wistar正常组比较，**P<0.01。

Note. Compared with the normal Wistar rat group,**P<0.01.

图1 三组大鼠肾上腺超微结构观察Fig.1 Observation of the ultrastructure of adrenal gland in rats of the three groups

通过电镜观察发现，Lewis大鼠在肾上腺和下丘脑组织的超微结构上均有与HYD组肾阳虚大鼠有着类似的病变，与Wistar正常组大鼠均有明显的差异，提示Lewis大鼠自发性肾阳虚体质的发生可能与HPA轴有关组织的超微结构改变有着密切联系。

3 讨论

肾阳虚证常伴有体重、体温下降，饮水尿量增多，下丘脑、垂体、肾上腺的病理改变以及HPA轴的功能失调等。现代医学研究表明，HPA轴在维持着中枢神经系统结构稳定方面起着重要作用，在HPA轴功能低下时，皮质类固醇能抑制Th1细胞的产生，Th1细胞则分泌IL-2、INF-γ和TNF-α能刺激B淋巴细胞而产生大量的自身抗体，同时诱导TGF-β的生成，使机体易患自身免疫性疾病[5]。HPA轴不同环节和不同程度的功能失调是肾阳虚证的主要病理环节之一[6-7]，而肾阳虚证的主要病理基础是下丘脑细胞的损伤和功能紊乱[8]。

构建肾阳虚动物模型是肾阳虚证研究规范化、客观化乃至科学化的重要环节。常见的肾阳虚模型主要有：药物造模方法、手术造模方法及根据中医病因病机造模方法等[9]，其中经典的是外源性糖皮质激素所致的肾虚模型。上述肾阳虚模型造模方法多单纯模拟肾阳虚证某一方面的机体变化和病理损伤，虽建立了多种客观诊断指标，但总体上这类模型缺乏方法学和相关影响因素的研究，与临床肾阳虚病症表现及病机并不相符[10]。因此，建立符合中医理论与中医临床证候特点相近，基于病因和病机的肾阳虚动物模型是肾阳虚证研究方面迫切需要解决的难题。

我们前期实验证明了Lewis大鼠体内存在HPA轴缺陷，与Wistar正常大鼠比较，Lewis大鼠体温、抓力、旷场中水平运动总距离均明显降低；水迷宫上平台时间和尿量略微明显升高；尿液中17OHCS和血清中Cort、CRH、ACTH、cGMP均显著降低(P<0.01)[4]。这些研究结果表明Lewis大鼠与肾阳虚大鼠在一般体征、行为学和17OHCS、Cort、CRH等肾阳虚标志性指标上存在着相似之处，因此我们认为Lewis大鼠可能具有自发性肾阳虚体质。

本实验拟基于Lewis大鼠肾阳虚体质的外在表现，通过Lewis大鼠与肾阳虚大鼠下丘脑中TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR mRNA表达和肾上腺、下丘脑组织超微结构的对比，进一步深入探寻Lewis大鼠自发性肾阳虚体质的内在证据。

通过实验发现，与正常Wistar大鼠比较，Lewis组大鼠下丘脑GR、IL-2 mRNA表达明显升高(P<0.01)，而下丘脑CRH、TNF-α、IFN-γ、IL-10 mRNA表达明显降低(P<0.01)；Lewis大鼠肾上腺皮质束状带略变薄，线粒体减少，且有轻微变形肿胀；Lewis大鼠下丘脑神经元细胞体胞核大，核形不规则，线粒体明显减少，神经细胞突触减少，突触前部的分泌小泡减少。以上实验结果证明，未经干预处理的Lewis组大鼠存在自发性的CRH基因低水平表达、HPA轴的功能失衡，存在免疫相关细胞因子基因的异常表达，下丘脑和肾上腺组织一定程度的病理改变，提示Lewis大鼠具有自发性肾阳虚体质，关于Lewis大鼠肾阳虚体质机制有待进一步的深入研究。

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Changes of the mRNA expression of "kidney yang deficiency"-related genes and ultrastructural observation of the hypothalamus in Lewis rats

ZHANG Li-zong, FANG Ming-sun , YANG Wei-ji , CAI Yue-qin,XU Jian-qin, SHOU Qi-yang*, CHEN Min-li

(Zhejiang Chinese Medical University. Hangzhou 310053, China)

Objective To observe the changes of mRNA expression related to kidney yang deficiency and the ultrastructure of hypothalamus in Lewis rats, and further study the constitution of kidney yang deficiency in Lewis rats. Methods Ten 7-8-week old SPF male Lewis rats and twenty 7-8-week old SPF male Wistar rats were used in this study. The rats received subcutaneous injection of hydrocortisone to establish kidney yang deficiency model. The expressions of TNF-α, IFN-γ, IL-10, CRH, MR and GR mRNA in the hypothalamus of the two groups were detected and the ultrastructural changes of hypothalamus and adrenal gland were observed to compare the differences between the two groups, and to explore the mechanism of kidney yang deficiency constitution in the Lewis rats. Results Compared with the normal Wistar rats, the expressions of GR and IL-2 mRNA in the hypothalamus were significantly increased (P<0.01), while the expressions of CRH, TNF-α, IFN-γ and IL-10 mRNA were significantly decreased in the Lewis rats (P<0.01). The zona fasciculata of the adrenal cortex was slightly thinner, the mitochondria were slightly swollen and the amount of mitochondria was decreased. The nuclei of hypothalamic neurons were larger, and the mitochondria, neuron synapses and secretory vesicles in the presynaptic neurons were decreased. Conclusions There are abnormal expression of immune-related cytokines and CRH mRNA, and ultrastructural changes in the hypothalamus and adrenal gland of Lewis rats with kidney yang deficiency. Such changes may be related to the functional imbalance of the hypothalamus-pituitury-adrenal axis.

Lewis rats; Wistar rat; Kidney yang deficiency; mRNA expression; Ultrastructure

SHOU Qi-yang. E-mail: sqy133@126.com

浙江省公益性技术应用研究计划(2015C37091)；国家自然科学基金(81573677)；浙江省自然科学基金(LY15H280006)；浙江中医药大学校级科技创新团队(XTD201301)。

张利棕(1981-)，男，实验师，研究方向：实验动物与动物实验。E-mail： ryan_zlz@163.com

寿旗扬(1979-)，男，副研究员，研究方向：比较医学。E-mail： sqy133@126.com

研究报告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0511-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.013

2016-01-22