Pristane诱导的系统性红斑狼疮小鼠模型的研究进展①

沈立军　孔 永　邱玉华

(苏州大学基础医学与生物科学学院免疫学系，苏州215123)

Pristane诱导的系统性红斑狼疮小鼠模型的研究进展①

沈立军孔 永②邱玉华

(苏州大学基础医学与生物科学学院免疫学系，苏州215123)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是由于机体免疫功能紊乱而导致的自身免疫性疾病[1]。在SLE患者的体内，细胞异常凋亡，细胞因子分泌失衡，T、B细胞过度活化，产生大量的自身抗体以及造成免疫复合物(Immune complex，IC)沉积，最终累及全身多器官系统造成损害[2-7]。虽然确切病因和发病机制仍不明确[8]，但一般认为SLE可由多种因素综合作用而诱发，其中环境因素在SLE的发病过程中具有重要的作用。

Pristane(降植烷)化学名为2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethylpenta-decane，TMPD)，是一种可来源于植物、海洋生物以及石油的类异戊二烯烷烃类化合物，其为细胞膜激活剂，可与脂质双分子和细胞膜结合，造成细胞毒性、导致细胞凋亡以及自身抗原的产生，进而打破机体免疫耐受及诱导自身免疫性疾病的发生[9]。1994年Satoh应用Pristane诱导BALB/c小鼠出现类似于人类SLE的症状，首次建立了Pristane诱导的狼疮小鼠模型[10]。与自发性狼疮小鼠模型所不同的是该模型侧重于研究环境因素打破机体免疫耐受以及导致SLE的机制，为探究非遗传因素在SLE发病过程中的作用，提供了有力的工具，现在也成为最常用的SLE小鼠模型之一[11，12]。本文就降植烷诱导的SLE小鼠模型作一综述。

1Pristane诱导的狼疮小鼠模型的制备及模型小鼠的症状表现

1.1Pristane诱导的狼疮小鼠模型的制作方法多种品系小鼠均可经一次性腹腔注射0.5 ml Pristane制备本模型[13]，使用该方法诱导狼疮小鼠模型，技术简便，但小鼠出现肾脏病变的时间较长，需要经过6～7个月才能诱导小鼠狼疮肾炎(Lupus nephritis，LN)的形成。

1.2Pristane诱导的狼疮小鼠模型的症状表现[14，15]BALB/c小鼠在经Pristane诱导2～4周后，出现抗ssDNA(single strand DNA)及抗组蛋白的IgM抗体，随后2～6个月内出现抗Su以及抗Sm/RNP(ribonucleoprotein)的IgG抗体，在第4～6个月时出现抗dsDNA(double strand DNA)抗体，小鼠全血和腹腔中IFN-α分泌细胞(CD11b+Ly6Chigh)以及脾脏中活化B细胞的比例亦显著高于对照组。模型小鼠在诱导后的第3个月时出现蛋白尿，6个月时尿蛋白程度1+～3+(30～300 mg/dl)；第3个月时开始出现关节滑膜增生，关节侵蚀性破坏等关节病变；第6个月时小鼠腹腔内脾脏、肝脏以及肠系膜等处出现数量、大小不等的脂肪肉芽肿(单核细胞、巨噬细胞吞噬Pristane油滴及淋巴细胞增殖聚集形成异位淋巴组织)[16]；6个月时小鼠肾脏出现节段性或弥漫性增生性肾小球病变：上皮和内皮细胞肿胀，系膜基质及系膜细胞增生，肾小球毛细血管袢增厚和单核细胞侵润，基底膜不规则增厚，内皮足突消失，上皮下及系膜区电子致密物沉积，IgG、IgM及C3沉积于系膜和肾小球毛细血管[16-18]。

高增燕采用C57BL/6小鼠制备Pristane诱导的狼疮小鼠模型，在诱导后第10天，发现小鼠脾脏中巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞以及B细胞均出现显著的活化，(B220+)B细胞表面CD21、CD86、MHCⅡ等分子的表达水平也出现不同程度上调；第3个月时在30%的小鼠血清中可以检测到抗核抗体(Antinuclear antibodies，ANA)的表达；第4个月时ANA阳性率进一步升高(80%小鼠可检测到其表达)，同时也检测到抗dsDNA抗体的表达(阳性率达89%)；第7个月时78%的小鼠出现蛋白尿，肾脏病理检查亦显示肾小球肿胀，淋巴细胞浸润以及IC沉积等典型的肾脏病变。

C57BL/10小鼠在经Pristane诱导后出现肺毛细血管炎以及血管周围巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞侵润；模型鼠肺泡上皮损伤、血管及肺泡出现中到重度炎症；从模型鼠气管肺泡灌洗液中检测出巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞，灌洗液中IL-6、IL-10的含量也显著高于对照组；经Pristane诱导后，在小鼠腹膜及腹腔实质器官可见脂肪肉芽肿；肾脏检测显示系膜基质和系膜细胞IgG和C3免疫复合物沉积[19]。

2Pristane诱导小鼠狼疮产生的影响因素

2.1微生物Mizutani[20]对Pristane诱导的无菌和普通级BALB/c小鼠进行了研究，发现Pristane诱导后，无菌小鼠和普通级小鼠均可出现腹腔内脂肪肉芽肿、高丙种球血症，血清中IgG2a/IgG1比率升高并出现抗Sm/RNP抗体(阳性率为40%)和抗Su(抗体阳性率43%)；同时也发现无菌小鼠和普通级小鼠腹腔细胞经脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)体外刺激后，IL-6及IL-12表达水平与对照组相比均升高，腹腔细胞可以产生高水平的IFN-γ(添加抗CD3抗体培养或添加PHA/conA培养)和IL-4(添加PHA/conA培养)。这些结果表明Pristane诱导小鼠产生自身抗体及高种球蛋白血症、分泌过量的细胞因子、形成腹腔炎症(脂肪肉芽肿)并不需要特定的微生物环境。

Hamilton[21]采用Pristane诱导制备BALB/c狼疮小鼠模型并比较了其在普通环境及SPF(Specific pathogen free)环境下的自身抗体生成表现，认为微生物环境可以协同Pristane刺激小鼠产生炎性环境/活化B细胞导致T细胞非依赖性的高丙种球蛋白血症，但对T细胞依赖性的抗Sm/RNP和抗Su抗体的产生却是非必需的。因此，采用Pristane诱导制备小鼠狼疮模型时，普通环境下饲养动物即可满足要求。

2.2小鼠品系目前建立Pristane诱导的狼疮小鼠模型常采用的是BALB/c(H-2d)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠，但是采用Pristane诱导小鼠产生自身抗体不需要限定品系，多种品系小鼠均可经Pristane诱导产生自身抗体，但所产生抗体的种类、频率以及滴度有所差别，受到H2连锁基因和非H2基因的共同影响。Satoh研究了多种品系小鼠经Pristane诱导后产生自身抗体的情况，检测发现A.SW (H-2s)小鼠C57BL/B6(H-2b)小鼠、BALB/c ByJ(H-2d)小鼠和DBA/1(H-2q)小鼠可以产生抗Sm/RNP抗体和抗Su抗体；A.SW (H-2s)小鼠、C57BL/6 (H-2b)小鼠以及C3H(H2-2k)小鼠可产生抗Rib P(ribosomal protein)抗体，然而BALB/c(H-2d)小鼠、DBA/1(H-2q)小鼠以及H-2k品系小鼠B6.H2k和BALB/K并不产生此抗体；抗dsRNA抗体的产生限定于C57BL/B6(H-2b)小鼠和B10.S(H-2b)小鼠。

2.3性激素雌激素对SLE的发病具有多种促进作用：促进初始B细胞生存活化相关基因的表达上调，增强其抗凋亡的能力，增加生发中心边缘区B细胞的数量以及保护自身反应性B细胞；促进T细胞、树突状细胞的活化成熟，降低外周血中单个核细胞的凋亡水平及TNF-α分泌，降低骨髓粒细胞-巨噬细胞克隆的数量[22]。

采用雌性小鼠建立Pristane诱导的小鼠狼疮模型，更容易诱导出狼疮病变，研究表明，采用Pristane诱导SJL/J小鼠建立狼疮模型，雌性鼠较雄性鼠有更高的死亡率(80% vs 37.5%，35周时)和更早的死亡出现时间(16周vs 24周)，同时雌性模型鼠也表现出高于雄性模型鼠的自身抗体(ANA、抗dsDNA)水平和更严重的肾脏病变[23]。

3Pristane诱导的狼疮小鼠模型的免疫病理机制

Pristane可以促进腹腔内巨噬细胞分泌IL-6等细胞因子，以及导致活性氧自由基、NO等活性中间体(可以导致细胞脂质、蛋白质及核酸的损伤)的产生，形成炎症环境[24]，并可通过线粒体途径诱导腹腔内细胞凋亡产生自身抗原，进而导致T、B细胞等异常活化以及产生自身抗体，最终出现组织器官的炎症损伤[25]。

Ⅰ型干扰素(IFN标签)与SLE自身抗体水平和疾病活动程度密切相关[26]，检测表明，在Pristane诱导的狼疮小鼠的体内Ⅰ型干扰素的表达水平存在明显升高的现象[27]。IFN-α可由未成熟的Ly6Chigh单核细胞通过TLR7/MyD88信号通路介导所产生。自身抗原抗体复合物作为启动物质诱导单核细胞表达IFN-α，IFN-α在相应趋化因子的参与下进一步可募集单核细胞并诱导其表达TLR7并反馈促进IFN-α的分泌；IFN-α可以促进DC成熟进而打破免疫耐受，致使自身反应性T、B细胞活化，增强CD8+T细胞的毒性作用并上调APC(Antigen presenting cell)表面共刺激分子的表达以及促进CD4+T细胞数量增加[28,29]。

Ⅰ型干扰素对于SLE的发病具有重要的作用，其对抗Sm/RNP等抗体的产生是必需的。研究显示，Ⅰ型干扰素受体缺陷(Ifnar-/-)的129Sv小鼠给予Pristane诱导后，在外周血细胞中未检测到Ⅰ干扰素刺激基因(type Ⅰ interferon stimulated genes，ISGs)的表达，尽管小鼠出现肾小球免疫复合物沉积，但并未出现狼疮特异性的抗Sm/RNP抗体和抗dsDNA抗体，也未出现蛋白尿和肾小球内细胞数目增加[29]。

IL-6是一种多功能性细胞因子，其对于机体免疫调节和炎症反应具有重要作用，在Pristane诱导的狼疮小鼠体内，IL-6可由Pristane诱导的脂肪肉芽肿内巨噬细胞以及腹腔内巨噬细胞等分泌产生。IL-6与SLE疾病活动程度及抗DNA抗体的表达水平相关，可以促进B细胞分化为浆细胞并产生IgG抗体，其表达水平的提高可以促进B细胞的自身反应性增强及自身抗体的产生[30-31]。Richards研究了Pristane诱导的IL-6缺陷(IL-6-/-)BALB/c自身抗体表达的情况，结果表明抗ssDNA抗体、抗dsDNA抗体以及抗染色质抗体的产生均依赖于IL-6的作用。

IL-6通过增强T细胞分泌IL-2和诱导其表面IL-2受体的表达，促进T细胞增殖及分化为功能性T细胞；促进巨噬细胞、表皮细胞以及肾小球系膜细胞的增殖分化，介导形成组织损伤[32,33]。

IFN-γ是重要的Th1型细胞因子，其表达水平与系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLE disease activity ind，SLEDAI)相关，IFN-γ可增强B细胞的自身反应性和自身抗体的分泌，可刺激肾小球系膜细胞CD40分子表达上调，活化单核细胞、巨噬细胞等促进炎症反应，造成细胞介导的免疫损伤，导致增生性肾小球肾炎。研究表明，IFN-γ缺陷(IFN-γ-/-)的BALB/c小鼠经Pristane诱导后，无免疫复合物沉积、肾小球肾炎以及蛋白尿出现，抗DNA/染色质IgG抗体表达水平也较对照组低，表明IFN-γ对Pristane诱导抗DNA/染色质抗体产生和狼疮肾炎病变具有重要作用。

IL-12可由巨噬细胞、树突状细胞产生，是IFN-γ产生的关键刺激因子，其与IL-18、IL-2协同作用诱导IFN-γ的产生，促使初始T细胞分化为Th1细胞以及介导Th1型免疫反应[34]。研究发现[35]，IL-12缺陷(IL-12 p35-/-)的BALB/c小鼠经Pristane诱导虽可以产生狼疮抗体和免疫复合物沉积，但并不出现蛋白尿及肾脏病变，这说明了产生抗Sm/RNP抗体和免疫复合物沉积不依赖IL-12，但IL-12对肾脏结构的损伤及Pristane诱导小鼠狼疮肾炎的形成是必需的。

4小结

采用非自身免疫性疾病易感鼠一次性腹腔注射降植烷的方式建立的诱导型SLE小鼠模型可表现出狼疮抗体产生、免疫复合物沉积以及狼疮肾炎等与人类SLE相似的症状。该模型制备方便，动物来源广泛，技术简单，易于实验操作，经济实用，对于研究环境因素诱发SLE的机制具有较好的应用价值。

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[收稿2015-05-10修回2016-04-20]

(编辑张晓舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.030

作者简介：沈立军(1986年-)，男，硕士，初级研究员，主要从事分子免疫学研究，E-mail:junwuxiy@163.com。 通讯作者及指导教师：邱玉华(1957年- )，女，教授，博士生导师，主要从事抗体工程与肿瘤免疫学研究，E-mail: qyh820@126.com。

中图分类号R593.24+1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0900-04

①本文为国家自然科学基金(No.81373236)。

②共同第一作者。