日粮中添加中链甘油三酯和半胱胺酸盐对断奶仔猪和生长育肥猪内源性生长轴的影响

孟春春（译）

（北京百迈客生物科技有限公司，北京 101300）

日粮中添加中链甘油三酯和半胱胺酸盐对断奶仔猪和生长育肥猪内源性生长轴的影响

孟春春（译）

（北京百迈客生物科技有限公司，北京 101300）

该文通过3个试验来检验总体假设，即在仔猪和生长猪的日粮中添加中链甘油三酯（MCT）和半胱胺酸盐（CSH）将会刺激其内源性生长轴，从而改善其生长和性能。试验1结果显示：日粮中添加MCT增加了断奶仔猪血浆中生长激素（GH）（P＜0.05）和生长激素促分泌素（Ghrelin）的浓度（P＜0.05）。此外，与对照组相比，MCT处理组减少了仔猪腹泻（P＜0.05），维持了其小肠绒毛高度（P＜0.05）且仔猪日增重稳定（P＜0.05）。试验2结果显示，MCT的添加增加了生长激素促分泌素（Ghrelin）（P＜0.001）、GH（P＜0.01）和胰岛素（P＜0.05）的浓度，且呈现出剂量依赖性；而日粮中添加MCT对猪只的日增重、采食量和饲料转化率无影响。试验3结果显示，饲喂3周后，与对照组和CSH处理组相比，MCT处理组的猪只血浆Ghrelin浓度明显升高（P＜0.05），而血浆GH浓度和体重则不受任何处理的影响。结论：试验1的结果表明日粮中添加MCT，可能是通过刺激生长激素内分泌途径将断奶相关病症（例如生长迟缓和腹泻）降到最低。在试验2和试验3中，尽管MCT和CSH的添加对猪只的增重或饲料转化率没有影响，但是增加了其生长轴的内分泌组分。

Ghrelin；生长；猪；促生长激素细胞

1 研究背景

生长激素是一种由垂体前叶促生长激素细胞分泌并受两种下丘脑神经激素调节的蛋白质，这两种下丘脑神经激素特异性作用以刺激（通过生长激素释放激素，GHRH）或抑制（通过生长抑素）生长激素GH的释放。GH的作用是通过增强肌细胞利用营养物质的能力，同时协调其他生理过程和组织来促进瘦肉的生长。已有研究表明日粮中添加巯基化合物半胱胺酸盐（CSH），可增加大鼠、绵羊和鱼中的GH分泌；在日粮中添加30 mg/kg和50 mg/kg的CSH可显著提高育肥猪的日增重，但对血浆GH浓度无影响；在日粮中添加70 mg/kg的CSH可提高肥育母猪的日增重，但在本研究中未检测GH水平。

生长激素促分泌素（Ghrelin），最初是从大鼠胃中分离出的一种GH释放肽，刺激GH从垂体前叶释放。已有研究表明在哺乳动物中Ghrelin具有多种生理功能，包括促进GH释放、食欲刺激、细胞增殖、细胞凋亡抑制，以及调节肌肉中脂类代谢和组织脂肪的分布。Salfen等人发现给断奶仔猪灌注5 d的Ghrelin，可促进GH分泌进而引起体重的增加。Ghrelin的主要活性形式是一种由28个氨基酸构成的肽，在此肽的第3个氨基酸（丝氨酸）上含有辛酸（C8:0）脂肪酸。翻译后C8修饰对于Ghrelin的生物活性是必不可少的，允许与其受体结合，这导致GH在垂体水平的释放。据报道，在椰子中提取的中链甘油三酯（MCT）具有高浓度辛酸，可直接用于大鼠中Ghrelin的生物活化。然而，目前对猪的研究中尚没有涉及在日粮中添加MCT对生长激素生长反应的影响以及Ghrelin生物活性水平在循环中受到的影响。

本研究共进行了3个试验来检验总体假设，即在仔猪和生长猪的日粮中添加MCT和CSH将会刺激其内源性生长轴，从而改善其生长和性能。试验1旨在探讨断奶仔猪的日粮中添加MCT是否会增加循环中Ghrelin的生物活性，并且具有生物活性的Ghrelin的增加是否将促进GH释放。试验2的目的是确定在生长育肥猪的饲料中MCT的最佳添加量，以研究生长激素生长反应。在试验3中，比较了日粮中MCT与CSH的添加对生长育肥猪的影响。

2 研究方法

2.1 试验1

选取24头21日龄大白猪与长白猪的杂交后代，公母各半，每头猪的平均体重在（5.12±0.24）kg范围之间，并将这24头猪分配到2个1.5 m×1.5 m室内猪舍，保持恒温28 ℃。将这些猪在恒温猪舍中饲养5 d以适应断奶后饲喂的乳猪料。每个恒温猪舍中都有一个奶头式饮水器和两个饮奶器。

在这5 d中，按照说明书向猪提供Pigiplus 商业合成的乳猪料，并向每8 L Pigiplus 中添加50 g干牛初乳和50 mL的益生菌。Pigiplus 含有约14%的脂肪、22%的蛋白质、43%的乳糖和0.2%的纤维。每间隔2 h清洗一次进料器并加入新鲜牛奶。5 d后，选择16头（8头公猪和8头母猪）健康猪只用于试验。将这些猪饲养于含有乳头饮水器和饮奶器的1.5 m×0.75 m猪舍中，然后将猪随机分配到2个处理组中，并确保两组的公母数量相同，有相近的血统关系和体重。2个处理组分别是对照组和MCT组，对照组饲喂乳汁替代品日粮（n=8；Pigiplus ），MCT组饲喂添加了5%MCT（MCT油）的乳汁替代日粮（n=8）。MCT油脂由含有辛酸（C8）（65%～75%），癸酸（C10）（25%～35%）和己酸（C6）（＜1%）的椰子油精制而成。为保证日粮所含的能量相同，在对照日粮中添加4.7%（v/v）菜籽油。持续饲喂5 d，每天测量活重和饲料剩余量。在试验期间，由相同的工作人员每天09:00和15:00对猪进行观察，记录是否出现腹泻的临床症状。如果在每天的任一观察时间点发现有新鲜稀粪黏附在猪的会阴处，或者在排便期间观察到稀粪，则该猪被记录为在当天具有腹泻症状。

在试验第5天，通过上腔静脉的静脉穿刺对试验猪只进行采血，每头猪采1 mL血样。将血液收集到有EDTA抗凝真空采血管中，立即离心，将血浆用1%（v/v）HCl酸化以防止Ghrelin降解，并且将所有样品立即储存于-20 ℃条件下。

在试验第6天利用达到致死剂量的Valabarb （戊巴比妥钠[镇静催眠药]）对猪进行安乐死，并从小肠（十二指肠、空肠和回肠）的各个区段收集组织样品。将这些组织在Bouin溶液（该固定液为组织学、病理学常用固定剂）中固定6 h，然后加工成蜡块，并使用切片机制作5 μm切片用于组织学观察。每个组织以200 μm间隔取得6个切片，并用苏木精和伊红染色。根据Pluske等人描述的方法，在H＆E染色的载玻片上进行绒毛高度和隐窝深度的测量。对于每个组织切片，在10个随机选择的视野中进行绒毛高度和隐窝深度的截面测量，此方法已被证明可以稳定计算结果的平均值和方差。

2.2 试验2

选择60头14～22周龄的大白猪（作为父本）与长白猪的杂交后代，分为4组，每组15头，并分别在单独的猪舍中饲喂，对照组饲喂标准商用饲料，其他3组分别以1%、3%和6%的比例在饲料中添加MCT（MCT油脂）。使用菜籽油调节日粮中的能量水平，并添加小麦和豆粕以保证足够的能量、蛋白质和赖氨酸，赖氨酸已被证明对于促进GH增加所必需的。每天测量活重和饲料剩余量。在饲喂MCT的第21天，每组选择生长速率接近于组平均值的猪6头，通过外耳侧或耳蝠处耳静脉插入临时导管进行采血（耳静脉插管技术与Zanella和Mendl采用的方法类似），每次取完血样后都用约1 mL含有5 IU/mL肝素溶液的无菌生理盐水进行冲洗，以避免两次采血间的污染。在插管后的第2天，以15 min间隔连续采取4 h血样于EDTA管中，每次取1 mL。每次采血将最初的2 mL血液弃掉，以避免所采的1 mL血样被生理盐水稀释。每次采血后立即离心，取200 μL血浆并将每只动物的血浆混合在一起，考虑到GH的偶发性分泌，用1%（v/v）HCl酸化并立即储存于-20 ℃条件下。将收集的样品用于后续的激素分析。

2.3 试验3

该试验使用62头大白猪和长白猪的杂交母猪，将其在产后大约10周龄时置于单独的猪舍中用商用饲料进行饲养以使其适应生长，直至16周龄时将其用于试验。将猪称重，做耳标，并随机分配到3个处理组中：对照组（普通商用饲料饲喂）、日粮中含有6%MCT组（基于试验2的发现）和日粮中添加CSH（半胱胺酸盐）组，每个处理组21头猪（对照组20头）。将CSH以70 mg/kg的剂量掺入饲料中。每周记录活重，每天记录饲料剩余量。在产后19周，从每组选择生长速率接近于组平均值的猪7头采血样。耳静脉插管和血液取样方法如试验2所述。在试验结束时，一旦猪达到适当的屠宰体重（95±5）kg，将猪送到商业屠宰场进行屠宰，并记录P2点背膘厚、胴体重和屠宰率。使用Hennessy分级探针4测量P2位点（最后一根肋骨处距背中线6.5 cm）处的背膘厚。

2.4 激素分析

从分析试验1、2和3组收集血浆中的酰基-Ghrelin、GH、IGF-1和胰岛素。使用ELISA试剂盒测定酰基-Ghrelin，该试剂盒测定的灵敏度为25 pg/mL，分别具有3.8%（CV）和7.5%（CV）的批内精确度和批间精确度。使用ELISA试剂盒测定GH。该测定的灵敏度为0.54 ng/mL，其中批内和批间的精确度分别为4.1%（CV）和9.1%（CV）。使用ELISA试剂盒测定IGF-1，灵敏度的测定为26 ng/mL，具有批内和批间精度分别为3.5%（CV）和8.1%（CV）。胰岛素使用ELISA试剂盒。测定的灵敏度为0.062 ng/mL，其中批内和批间精密度分别为3.5%（CV）和6.9%（CV）。

2.5 统计分析

对数据进行方差分析，将处理和时间作为固定效应，动物（ID，同胞关系和性别）作为随机效应。使用事后Fisher's最小显著极差法来检验在每个时间点处理之间的特异性差异。使用卡方分析检验腹泻发生率的差异。

3 结果

3.1 试验1

在5 d的试验中，有显著的时间效应（P＜0.01），但是处理对于饲料摄入量或者处理和时间的相互作用对于饲料摄入量均无显著性影响。时间或处理对于平均日增重（ADG）和饲料转化率（FCR）均没有显著影响，但是处理和时间有显著的相互作用（P ＜0.05）。具体来说，相对于对照组，MCT组在第2天（343 g/d相对于246 g/d）和第3天（394 g/d相对于235 g/d）的ADG显著增加（P＜0.05）。在第5天，与对照组（240 g/d相对于160 g/d）相比，MCT组的ADG显著增加（P＜0.05），对照组的ADG在试验的最后2 d下降了近60%。在试验的第3天和第5天，MCT组的FCR分别比对照组约增加45%（P＜0.05）和降低40%（P＜0.01）。此外，观察到对照组8头猪中的4头在试验的最后2 d内具有明显的腹泻，而在试验过程中MCT处理的猪并未出现腹泻（P＜0.05）。

在试验之前，测量的任何血浆激素在仔猪组之间没有差异。总体而言，时间或处理对任何激素没有影响，但是处理和时间的相互作用对Ghrelin（P＜0.05）、GH（P ＜0.05）和胰岛素（P＜0.001）均有显著性影响。具体来说，在处理的第5天，与对照组相比，MCT处理组中血浆Ghrelin浓度增加了16%（P ＜0.05）。血浆GH浓度在第5天没有差异，但是在第0天和第5天之间GH浓度的变化存在显著性差异（P＜0.05），在对照组中降低了34%，而在MCT组中增加了13%。在处理的第5天，MCT组的血浆胰岛素浓度降低4倍（P＜0.001），但血浆IGF-1浓度没有差异。肠道形态的组织学分析表明，与MCT处理组相比，对照猪中小肠十二指肠和回肠区的绒毛高度降低了约25%。

3.2 试验2

与整个试验期间的对照组相比，日增重、采食量和饲料转化率不受在日粮中添加3个水平（1%、3%和6%）的MCT中任一个的影响。在第17周，采集的合并血液样品的血浆激素分析表明，MCT添加剂以剂量依赖性方式增加Ghrelin（P＜0.001）、GH（P＜0.01） 和胰岛素（P＜0.05）的浓度。相对于对照组来说，6%MCT添加量可导致Ghrelin浓度增加48%（P＜0.001），GH浓度增加130%（P＜0.05），胰岛素浓度增加33%（P＜0.05），而MCT添加剂对循环IGF-1浓度没有影响。

3.3 试验3

与整个试验期间的对照组相比，日增重、采食量和饲料转化率不受MCT或CSH添加剂的影响。达到屠宰体重（95±5） kg所需天数、胴体重和屠宰率在处理组之间均没有显著性差异。与对照组相比，MCT和CSH处理组的猪在P2点背膘厚有显着差异，MCT饲养的猪P2点背膘厚降低了19%（P＜0.01），CSH猪降低了14%（P＜0.01）。处理组猪之间的血浆Ghrelin平均浓度存在总体差异（P＜0.05）。具体来说，饲喂MCT猪与对照猪相比Ghrelin浓度增加26%（P＜0.05），且与CSH猪相比Ghrelin浓度增加46%（P＜0.01）。但处理组之间的GH、IGF-1或胰岛素浓度没有差异。

4 讨论

4.1 试验1

本研究发现，虽然添加5 d的5% MCT油脂对增加猪只采食量或促进其生长没有影响，但似乎抑制了对照猪中观察到的腹泻相关的生长率下降。还有证据表明，日粮添加MCT可用于增加具有生物活性的Ghrelin血浆浓度。本研究结果与Nishi等人的研究结果是一致的，他们在大鼠中证明了日粮中添加5%MCT油脂可增加酰化Ghrelin的血浆浓度，而不改变总Ghrelin水平。MCT试验组日粮中所含的辛酸可以附着于去酰基化的Ghrelin（无活性）肽的第3个氨基酸（丝氨酸），这种修饰允许Ghrelin肽与其受体结合，因此是必需的生物过程。Salfen等人发现饲喂5 d的Ghrelin可促进猪只增重并伴随断奶仔猪GH分泌增加。虽然本研究结果表明循环GH浓度受到了影响，但是这与Salfen等人的发现是相悖的，这可能是因为通过饲喂MCT和输注MCT两种方式所导致的Ghrelin增加量不同，前者导致生物活性Ghrelin水平增加约16%，而后者导致总Ghrelin水平增加了25倍。虽然这两个研究测量不同形式的Ghrelin分子，但反应的幅度差异值得注意。增加日粮中MCT油脂的添加量以获得更高的生物活性Ghrelin水平可能是有问题的，因为高油脂含量可能导致营养不平衡的饮食。此外，对新生仔猪的一项研究发现，MCT-油脂的过量添加可能导致麻醉效应，这可能导致仔猪活力下降，从而增加其死亡率。

4.2 试验2

本研究表明，相比1%和3%的添加比例来说，生长猪或育肥猪日粮中添加6% MCT对于增加具有生物活性的Ghrelin和循环GH浓度是最佳的添加比例。然而在本研究中对生长性能没有影响，一个可能的原因就是6% MCT日粮添加处理（约14 ng/mL，与对照相比增加2倍）引起的GH刺激水平不足以显著性影响猪的生长。Hansen等人发现，给生长猪每日注射pST（猪生长激素）可促使内源性GH浓度提高到约14 ng/mL，这对肌蛋白的沉积没有影响。而Klindt等人发现，pST埋植剂可促使阉割雄性猪的内源性GH浓度提高到约30 ng/mL，从而导致平均日增重增加22%。事实上，在本研究中缺乏添加MCT对IGF-1水平的作用也表明GH刺激仅仅是适度的。

4.3 试验3

在生长猪或育肥猪的日粮中添加6% MCT或CSH可以增加内源性GH水平、提高体重增加速率和饲料转化率的假说并未得到证实。日粮中添加MCT或CSH对血浆GH浓度、平均日增重或采食量没有影响。然而，MCT确实增加了循环中的活性Ghrelin水平，并且MCT和CSH都降低了P2点背膘厚。对生长系统影响甚微的原因尚不清楚，然而从Etherton等人的研究中可以得到，pST注射后血浆GH浓度增加至约25 ng/ mL，从而引起体重增加，缺乏GH刺激可减弱对体重增加和采食量的影响。添加MCT和CSH的动物缺乏GH反应的原因可能包括：1）MCT对生物活性Ghrelin的刺激不足，以及CSH对生长抑素的抑制不足，导致GH水平升高；2）动物数量不足以获得GH或生长刺激的适度增加；3）MCT和CSH处理可能最初增加了GH水平，但是这种效应在血液采样当天没有持续。

5 结论

试验1中的数据显示，在日粮中添加MCT作为一种为机体提供活化Ghrelin的方式，可能是导致绒毛高度增加的机制。虽然试验期太短，无法检测MCT对生产的长期影响，但有一些建议认为MCT减少了哺乳仔猪的腹泻，并减少了断奶后GH水平的下降。

在试验2和试验3中，除了刺激循环生物活性Ghrelin的浓度之外，MCT对生长性能或生长轴的刺激没有影响。CSH对生长性能或刺激生长轴也没有任何影响，这表明该试验设计不足以获得GH水平和体重增加的适度变化，或者MCT和CSH对背膘减少的影响是独立的，与生长激素的作用无关。

（原文作者：David W. Miller1⋆,Zoe Prosser1,Edward Y. W. Chee1,Christian F. Hansen2,Frank R. Dunshea3,Bruce P. Mullan4and John R. Pluske1）

（原文链接：http://jasbsci.biomedcentral. com/articles/10.1186/s40104-016-0121-9）

2016-11-01）