猪流感的流行现状及分子生物学诊断方法研究进展

于新友，李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

猪流感的流行现状及分子生物学诊断方法研究进展

于新友，李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性、高度接触性猪呼吸道传染病，给养猪业造成很大的危害，猪流感病毒也可感染人类，威胁人类的生命健康。文内通过综述我国猪流感的流行现状及分子生物学诊断方法的研究进展情况，以期对猪流感的诊断和防控工作提供参考。

猪流感；流行现状；分子生物学；诊断

猪流感(swine influenza，SI)是由猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。该病有明显的季节性，早春、深秋和寒冷的冬季多发，各种年龄、性别和品种的猪均可感染[1]，临床表现主要是发病急、呼吸困难、咳嗽、流泪、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[2]。SIV可损害猪免疫系统，引起免疫抑制，继发感染其他疾病，加剧病情，降低生产性能，给养猪业造成巨大的经济损失。由于猪呼吸道内同时具有人流感和禽流感的唾液酸受体，因此，猪是禽、猪、人流感病毒共同易感宿主，是流感病毒基因重组或重配的“混合器”[3]，猪流感的公共卫生学意义日益突出，在流感大流行中起着重要的作用[4]。本文简要综述了近年来我国猪流感的流行现状与SIV分子生物学诊断方法研究进展情况，希望广大基层兽医工作者对SI引起足够的重视，从而建立有效的诊断和防控机制，最大程度地减轻SI对养猪业所造成的危害。

1 我国猪流感流行现状

1918年美国首次报道了猪流感[5]，迄今为止，欧、美、非、亚、澳等世界各大洲均有猪流感的发生和流行。目前，已经分离的血清型有H1N1、H1N2、H2N3、H3N1，H3N2、H1N7、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等，在我国猪群中流行较广的主要是H1N1，H1N2和H3N2，也有H5N1和H9N2感染猪的相关报道[6-7]。王进香等[8]采用血凝抑制试验(HI)对宁夏22个县(区、市)43个规模猪场、10个屠宰场、197个散养户的1 710份猪血清样品进行了猪流感病毒H1、H3亚型抗体的检测。结果显示，被调查的样品中，H1亚型抗体阳性率为11.81%，H3亚型抗体阳性率为0.46%，H1+H3亚型抗体阳性率为0.35%。刘旭等[9]对甘肃省14个地、市、州规模化养猪场未免疫流感疫苗的380份猪血清进行了猪流感H1N1、H3N2、H5和H9抗体检测，结果发现在多个市、州的猪群中检出H1N1、H3N2、H5和H9抗体，阳性率分别为35.26%、28.15%、1.05%和7.89%。陈锦成等[10]采用HI对采集于广东、湖南、河南省12个市县28个规模化猪场的799份血清进行H1和H3亚型猪流感病毒的抗体检测。结果表明，H1亚型抗体阳性率在0～83.33%之间，猪抗体总阳性率为46.18%(369/799)，猪场阳性率为89.29%(25/28)。H3亚型抗体阳性率在0～100.00%之间，猪抗体总阳性率为61.33%(490/799)，猪场阳性率为85.71%(24/28)。广东、湖南和河南地区H1亚型抗体阳性率分别为48.91%、40.26%和50.67%，H3亚型抗体阳性率分别为58.55%、70.78%和 78.67%。在被调查的上述3个地区的猪群中，H1和H3亚型猪流感病毒的感染较为普遍，其中H3亚型感染率高于H1亚型，且各地区猪流感病毒的流行情况存在地域性差异。李凯航等[11]2011年对上海市46个场户的723份猪血清应用HI和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行了检测。结果显示：该市猪群中猪流感病毒的H1亚型为优势亚型，H3亚型病毒感染率较低，被检场户流感病毒抗体的场阳性率为1.25%～100%，样品阳性率为1.3%～74.7%。曹振鹏等[12]采用ELISA方法和HI对2011—2012年采集的1 050份血清样品进行SIV血清学检测。两种检测方法结果显示1 050份血清样品中SIV抗体阳性率分别为50.4%(ELISA)和50.2%(HI)。其中珠三角地区和粤东地区的感染率高于粤西地区。SIV亚型调查结果显示该地区流行的SIV主要为H1和H3亚型，抗体阳性率分别为39.2%和18.2%(ELISA)。部分猪场存在H9亚型SIV抗体。部分猪群中同时存在H1和H3两种亚型SIV抗体，表明猪群中存在不同亚型SIV混合感染。刘丽萍等[13]于2012年10月至2013年12月从全国养猪重点省份的养殖场、屠宰场采集猪血清样品共计5 856份，采用HI进行猪流感抗体检测。结果显示，我国猪群中SIV抗体阳性率分别为55.52%、13.92%和2.00%，其中H1N1 SIV抗体平均阳性率高于其他亚型。2013年1月和3月份，又集中在广东和湖南两个省份的部分养殖场和屠宰场采集猪血清样品共计9 910份，采用ELISA进行抗体检测。结果共检出阳性血清3 518份，平均阳性率分别为36.14%和34.89%。王刚等[14]于2009—2014年期间分别从西藏林芝、拉萨、山南、日喀则、昌都和那曲等地区随机采集猪血清1 537头份，采用ELISA法进行抗体检测。结果表明：西藏地区SIV H1N1抗体阳性率达71%，SIV H3N2抗体阳性率达27%，SIV H1N1和H31N2抗体阳性重复率达19%。何淑仪等[15]采用HI，对2013—2014年从5个省份采集的2 208份血清样品进行SIV血清学检测，结果显示阳性血清共1 269份(57.42%)，其中广东省和广西省的感染率最高(P＜0.01)。H1N1 SIV、H3N2 SIV抗体阳性率分别为22.51%、32.97%。H1N1 SIV和H3N2 SIV在冬季血清阳性率最高，然而在冬末(2月)阳性率却最低(P ＜0.01)。母猪的H1N1 SIV抗体阳性率高于仔猪和育肥猪，但仔猪的H3N2 SIV抗体阳性率却比较高。隋金钰等[16]分别对2013年11-12月期间采集于福建等9个重点养猪省份的2 198份以及2014年3-4月期间采自于广东和湖南两省的3 654份猪血清样品进行了血凝抑制抗体的检测。结果显示，2013年我国猪群中欧亚类禽型猪H1N1、2009/H1N1、H3N2 SIV、H5N1 AIV、H9N2 AIV及H7N9流感病毒平均抗体阳性率分别为49.73%、11.87%、1.71%、0、0、1.36%，2014年分别为48.52%、12.10%、1.04%、0、0、2.05%。

2 猪流感病毒分子生物学诊断方法研究进展

2.1 核酸探针

核酸探针技术是常用的分子生物学诊断技术，它具有操作简单，不受抗原抗体反应的限制，结果易于判定等优点。Junk等用非放射性地高辛标记的582个碱基cDNA探针来检测A型H1N1 SIV编码核蛋白的RNA，阳性细胞呈明显的暗黑色，证明该探针有较好的特异性和敏感性。吕翠等[17]以地高辛标记SIV基质蛋白(M)基因的保守片段制成核酸探针，与H1及H3亚型的SIV的cDNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA、猪圆环病毒2型的DNA、猪瘟病毒cDNA、猪伪狂犬病的DNA进行斑点杂交，以检测探针的特异性，结果该探针仅与H1及H3亚型的SIV的cDNA杂交呈阳性，与其余病毒杂交呈阴性，敏感性试验显示，探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物，应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测，结果检出9份阳性，与RT-PCR检测结果一致。

2.2 RT-PCR方法

RT-PCR是以病毒的RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测病毒的方法，以其简便、迅速、灵敏等优点在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。王隆柏等[18]根据GenBank发表H1N1、H1N2和H3N2亚型猪流感病毒M基因片段的引物序列，设计合成1对引物，建立猪流感病毒RTPCR检测方法。结果显示，该法能扩增出675 bp的基因片段，同条件扩增的伪狂犬病毒、猪瘟病毒、圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性，可检测到3.5 pg猪流感的核酸，能从被流感病毒感染的小白鼠和疑似猪流感的病料中检测到SIV。

2.3 多重RT-PCR方法

多重PCR是在单一PCR基础上发展起来的，通过寡核苷酸引物组合，在一个PCR反应体系中同时扩增多个靶序列，其扩增的特异性和效率与单一PCR相当，但同时可扩增针对不同模板的多个靶序列，能节约时间和精力。齐海涛等[19]根据GenBank中H1N1和H3N2亚型SIV血凝素、神经氨酸酶和M基因保守序列，分别设计合成了5对特异性引物，利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明，该方法的型RT-PCR可以检测出104EID50病毒量所提取的RNA，H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外，对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测均为阴性。王洪光等[20]根据GenBank登录的相关病毒基因序列，选择保守区域设计引物，经过反应条件的优化，建立了可同时检测以猪繁殖与呼吸综合征病毒与SIV的RT-PCR诊断方法，扩增的目的片段长度分别为364 bp和981 bp。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性，对猪繁殖与呼吸综合征病毒和SIV的核酸检测最低浓度分别为3.2×10-3ng和2.7×10-3ng。应用该方法对32份临床样品进行检测发现，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性率为43.8%，SIV阳性率为31.3%，二重感染率为9.4%。韦冠东等[21]根据GenBank登录的相关病毒基因序列，选择保守区域设计引物，经过反应条件的优化，建立了可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒与SIV的三重RT-PCR诊断方法，扩增的目的片段长度分别为364 bp、530 bp和981 bp。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性，对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和SIV的核酸检测最低浓度分别为3.2×10-2ng、8.3×10-2ng和3.7×10-2ng。

2.4 荧光定量RT-PCR方法

实时荧光定量PCR是融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。张太翔等[22]选取SIV的核蛋白基因序列设计引物和探针，建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品，进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有“S”型扩增曲线，检测灵敏度为20个拷贝/μL，并根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性，对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。刘好朋等[23]根据H1亚型SIV血凝素基因保守序列，分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针，建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示，该方法的敏感性可达102拷贝/ μL，除H1亚型SIV外，对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性，且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测，其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。王建华等[24]分别根据尼帕病毒(NiV)和SIV的M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针，通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法，对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示，用该方法检测NiVM基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIVM基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA)，定量线性范围分别为4.6×101copies/ μL-4.6×108copies/μL和 5.8× 101copies/μL-5.8×108copies/μL，检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%，显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线，不与猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒发生交叉反应。

2.5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本学者Notomi等发明的一项恒温核酸扩增技术，具有操作简便、快速、敏感、特异等特点，特别适合在现场和基层部门应用。苏霞等[25]从GenBank中获得H1N1 SIV血凝素、神经氨酸酶基因序列，应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列，利用Primer ExplorerV4软件在序列保守区域设计LAMP引物，即外引物和内引物，同时以H1N1 SIV的cDNA作为阳性模板，对实验中的几个反应条件进行优化。建立H1N1 SIV LAMP快速检测方法。结果显示，该法对H1N1 SIV的灵敏度达到4～6个拷贝，其引物对于H9亚型禽流感病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒均无非特异性扩增，表现出良好的特异性。张莉等[26]针对SIV NP基因保守区域设计并合成6条引物，建立了SIV的LAMP检测方法，并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示，该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒，但不能检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒，该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。

3 小结与展望

SI是一种世界性的猪的呼吸道传染病，在猪场内广泛存在，是规模化养猪场的常发病，并呈现地方流行性，单纯感染SIV后，猪死亡率并不高，但SI是一种免疫抑制性疾病，容易导致其他病原继发感染，造成猪大量死亡。SIV能感染人，威胁人的生命安全，因此，平时要加强猪饲养管理和日常卫生消毒工作，降低饲养密度，增强猪的抵抗力，控制好猪只和人员进出，防止疫病的传入，可以定期免疫现有灭活疫苗，有条件的猪场也可分离出相应毒株，委托一些生物制品企业生产自家苗。对已发生猪流感的猪场，对全群猪紧急免疫接种灭活疫苗，并肌注抗生素，避免其他细菌病的继发感染，隔离病猪，保证病猪的休息和营养，加强管理，防止病毒传播。一旦发现猪疑似感染猪流感，一定要做好个人防护工作，尽量佩戴口罩、手套、帽子，接触后洗手、洗澡，避免感染SIV。

SI及时准确的检测对其防控意义重大，目前SI的血清学检测方法主要有HI和ELISA，但这些方法不能区分是疫苗毒还是野毒产生的抗体，而病原检测中病原分离、鉴定的检测方法虽然准确、可靠，但耗时太长，满足不了临床快速确诊的需求，因此，需要采用近几年发展起来的分子生物学方法进行检测，虽然目前已经建立了多种分子诊断方法，在临床SI的诊断中起到了一定作用，但这些方法都有利有弊，如常规RT-PCR方法敏感性不够高，可能造成漏检，且不能实现对病毒的定量检测，荧光定量RT-PCR方法可弥补常规RT-PCR的缺点，但对人员和设备仪器要求太高，基层人员不易掌握仪器的操作使用和结果的分析，需要仪器和耗材的维持运作费用较高，不适合兽医基层单位大规模推广和应用。LAMP方法检测快速、简便，适合在基层兽医和养殖场进行推广使用，但容易出现假阳性结果，上述检测试剂的核酸检测试剂均需要冷冻保存，成本高昂且运输半径极其受限，随着分子生物学技术的不断发展，目前对其他疾病的检测方面已经研制出了基因试纸卡检测盒，具有LAMP检测方法的优点，又能避免假阳性的出现，操作简单，全程时间短，最重要的是检测试剂不需要冷冻保存，易保存和运输，适合基层兽医部门应用，笔者认为基因试纸卡及其配套适合携带的简易核酸制备设备是未来SIV检测试剂的研究方向。

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2016-05-10）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-06-022-15) ，山东省自然科学基金项目(ZR2013CQ006)，山东省自然科学基金青年基金项目（ZR2014CQ010）

于新友(1983-)，男，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断技术研究