新城疫病毒反向遗传技术的研究进展

戴建华，高 崧

（1.扬州大学兽医学院，扬州225403；2.江苏农牧科技职业学院，泰州225300）

·综述·

新城疫病毒反向遗传技术的研究进展

戴建华1，2，高 崧1

（1.扬州大学兽医学院，扬州225403；2.江苏农牧科技职业学院，泰州225300）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在分类上属于副粘病毒科、副粘病毒属（Avulavirus），是单股、负链、不分节段的RNA病毒。反向遗传技术是指从生物遗传物质DNA或RNA入手，通过对遗传物质进行加工、修饰以及替换等，来研究基因突变后产生的生物学特性变化，从而确定生物体基因组的结构与功能以及这些突变可能对生物学特性的影响。目前该技术已经成为病毒学领域中研究基因功能的最有效方法。本文简述了NDV反向遗传操作系统的构建过程以及利用该技术在NDV研究中的最新成果。

新城疫病毒；反向遗传；毒力；病毒载体

1　病毒概况

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在分类上属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒属（Avulavirus）中的成员，是单股、负链、不分节段的RNA病毒［1］。目前NDV的核苷酸总数有3种长度，分别为15 186、15 192、15 198 nt。NDV的基因组结构为3'-NP-P-M-F-HN-L- 5'，共编码6种结构蛋白，即核衣壳蛋白（nucleoprotein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基质蛋白（matrix protein， M）、融合蛋白（fusion protein，F）、血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase protein， HN）和RNA聚合酶蛋白（RNA-dependentRNA polymerase protein，L）。此外NDV的P基因转录过程中可在第484特定位置插入非模板G碱基发生RNA编辑现象，产生V和W两种非结构蛋白，位于囊膜上的F蛋白和HN蛋白是主要的保护性抗原［2，3］。

2　新城疫病毒反向遗传技术

1999年Romer-Oberdorfer等［4］和Peeters等［5］所在的实验室几乎同时发表了新城疫病毒拯救成功的研究报道。到目前为止，许多不同基因型、不同毒力的毒株已被成功拯救。NDV的反向遗传技术主要包括病毒基因组全长cDNA克隆的构建、NP、P和L基因表达质粒的构建和鉴定以及进行质粒共转染三部分。

2.1感染性cDNA克隆的构建 构建感染性cDNA克隆一般是通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分段扩增RNA病毒基因组cDNA片段，然后利用人为设计或基因组中天然存在的特异性限制性酶切位点，将各个cDNA片段按病毒基因组顺序依次克隆至低拷贝质粒载体中，从而获得病毒基因组全长cDNA感染性克隆。基因组3'端和5'端的克隆，大多采用cDNA末端快速扩增法（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）。由于高拷贝载体在复制过程中经常出现插入片段的缺失或突变，为保证全长克隆构建的成功率，大多采用复制严谨性较高的低拷贝载体。通常在低拷贝载体中还需加上一些必要的元件如T7启动子、有自我剪接功能的丁肝核酶基因、转录终止信号和便于插入外源片段的多克隆位点等。将RT-PCR获取的基因组cDNA按顺序置于转录载体中的T7启动子之后、丁肝病毒核酶基因和T7终止子之前，便完成了转录载体的构建［6-8］。2012年Li等［9］将I系苗Mukteswar的的全长序列置于CMV启动子和牛生长激素（bovine growth hormone，BGH）的polyA之间，将此质粒转染普通的BHK-21细胞，在细胞内RNA聚合酶II的作用下，产生具有精准末端的反义基因组序列，同样获得了有感染性的病毒粒子，而且其拯救效率显著高于T7启动子。

所有的单股负链RNA病毒从cDNA克隆拯救感染性病毒的另一个重要环节是装配功能性RNPs［10］。在NDV复制过程中，首先是病毒RNA聚合酶以核衣壳化的（-）ssRNA（RNPs）为模板，进行各基因的转录。功能性RNPs形成需要NP、P和L蛋白的协同作用，可表达这3种蛋白的质粒被称作辅助质粒。辅助质粒构建之后，通常采用微型基因组的方法来鉴定辅助质粒是否具有正常的生物学功能。微型基因组保留病毒的顺式作用元件和调控区（一般为病毒基因组两端的非编码区，non-coding region），在编码区启动子（如T7启动子）下游反向引入SEAP 或GFP等报告基因，两端为病毒复制所必需的病毒前导序列和尾随序列等调控序列所构成的cNDA克隆。因报告基因的插入方向与启动子的转录方向相反，因此当微型基因组转录成RNA后，只有在病毒辅助质粒提供的辅助蛋白的作用下，才能生成反微型基因组意义链RNA，从而最终表达出报告基因蛋白。将微型基因组与辅助质粒共转染，微型基因组可在细胞内复制和转录，通过鉴定报告基因的表达即可衡量辅助质粒的功能活性及所建立的拯救系统［11，12］。

2.2病毒的拯救 构建好的3个辅助表达质粒与含全长克隆的转录载体，一起共转染已感染能表达T7 RNA聚合酶的痘病毒（vTF7-3、MVA-T7或FPV-T7）的普通细胞，或直接转染能稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系，从而进行病毒的拯救。但VV/T7系统也有局限性，VV的复制可能干扰被拯救病毒的产生，VV在感染时产生细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），最终会杀死细胞，因此外源基因表达并非一个连续过程，很可能外源病毒未被拯救，负载的细胞已经破裂。目前仍不清楚VV表达的T7 RNA聚合酶是进入细胞核内转录重组质粒，还是直接在细胞质中起作用，研究人员普遍认为T7 RNA聚合酶的“工作场所”是细胞质。因此，许多学者寻求更为安全的替代系统，例如：构建直接表达T7聚合酶的细胞系，它的应用极大地方便了病毒的拯救，只需往此细胞系转染含病毒基因组cDNA克隆和辅助表达质粒就可以拯救出病毒，但是T7 RNA聚合酶的表达效率偏低［13，14］。

值得一提的是，Gao等［15］在基于T7 RNA聚合酶的平台基础上，开发出了一种更加容易操作的NDV拯救系统。他们将NDV 弱毒B1株的3个外部基因M、F、HN和外源GFP基因连入1个带有T7启动子的转录载体中。3个内部基因NP、P、L和RFP连入另一个带有同样启动子的转录载体。然后将这2个含有全长序列的转录载体和NP、P、L3个辅助质粒共转染至表达有T7 RNA聚合酶的细胞中，结果拯救出了稳定表达黄色荧光的NDV。重组病毒的生长特性与母本病毒一致，结果证明将NDV 的全长基因组分成两个独立的片段，再与辅助质粒共转染也能够完成感染性RNPs的组装。副粘病毒病毒基因组比较庞大，构建全长cDNA克隆需要分多次扩增拼接，而且还容易引入突变造成病毒拯救失败，如果能将病毒RNA分2个质粒转录，将大大简化病毒拯救的流程和提高成功系数。

3　反向遗传技术在NDV毒力研究的应用

通过反向遗传技术证实F基因的裂解位点是决定NDV毒力的主要因素［16，17］。目前研究人员更多的是聚焦于F基因裂解位点之外来寻找NDV毒力的分子基础。HN蛋白是NDV的另一个囊膜糖蛋白，过去研究人员认为其功能主要有两个方面，蛋白中的血凝素部分负责病毒结合细胞的受体；神经氨酸酶部分则将复制完毕后的子代病毒与宿主细胞裂解分开，其总体并不影响NDV的毒力［2］。随着反向遗传技术的出现，发现HN蛋白中的多个位点对毒力有显著影响。2009年Khttar等［18］以中等毒力的BC株为骨架，在HN蛋白的保守区选择了3个点进行了突变。经测试发现526的Y变成Q后，病毒受体吸附能力，神经氨酸酶活性以及毒力都大幅下降。2010年Yan等［19］通过反向遗传平台删除HN基因的5'和3'的非翻译区，发现缺失5'非翻译区的病毒，其HN基因的mRNA表达水平和HN蛋白在病毒颗粒中含量都有所下降，并导致重组病毒对鸡的致病力有显著下降。结果表明HN基因的5'非翻译区与病毒的致病力有显著相关性。Qiu等［20］通过PCR突变的方法以VII型病毒ZJ1的感染性克隆为模板，构建出了V蛋白缺失的病毒rZJ1-VS，并揭示了由于V蛋白功能丧失导致重组病毒不能有效降解磷酸化STAT-1，反而引起IFN-α的大量增加，使得病毒滴度降低进而毒力下降。

长期以来一直认为NDV的聚合酶蛋白不影响其毒力，但近期研究发现，聚合酶蛋白亦可显著影响NDV的毒力。2008年Subrat等［21］分别以弱毒株La Sota和中等毒力的BC 株的感染性克隆为骨架，将两者的L基因进行替换，结果发现嵌合有BC株L基因的rLaSota BCL 致病力显著增强，有力证明了L蛋白亦是NDV的决定因素之一。随后Dortmans等［22］将1株鸽源NDV使用SPF鸡连续传代5次，将P5代病毒进行全基因组测序发现其共有3个氨基酸的变化，2个位于L蛋白，1个位于P蛋白，此时P5代病毒的ICPI值已由亲本株0.44上升至0.90。随后他们构建了亲本株的感染性克隆，在此基础上对上述3个点进行了同样的突变，比较后发现突变株较母本病毒在毒力方面有了显著增强，而且在单层细胞上的空斑大小也有明显变化。上述结果进一步佐证了NDV的毒力不仅是由F0蛋白裂解位点决定，而是由多基因共同参与的结果。

4　反向遗传技术在ND疫苗研制的应用

通过新城疫病毒的反向遗传平台，人们可以在DNA水平上通过突变、替换、缺失、插入或互补等手段，来研究DVA的基因复制和表达、病毒蛋白与宿主的相互作用及抗病毒策略，进而对各基因中特征性位点的具体生物学功能有进一步的认识。过去研究人员随机依靠流行病学分离和人工诱变筛选疫苗候选株，现在通过反向遗传技术可以针对性、方便地对病毒的遗传信息进行改造，拯救出用于不同目的NDV疫苗候选株，为更好地防制新城疫这个严重危害世界养禽业的烈性传染病提供了新的保障。

4.1NDV新型疫苗 Peeters等［23］在已建立的NDV反向遗传操作基础上，将NDV LaSota株的HN基因用HN的胞浆区、跨膜区、基质区和禽副粘病毒4型HN基因的免疫原性球状区基因代替，构建了含嵌合HN基因的NDV。重组的NDV失去血凝活性，但免疫4周龄SPF鸡后用致死剂量NDV，攻击重组NDV可完全保护SPF鸡。所建立的这一方法可将NDV重组疫苗免疫动物与自然感染动物区分开来，这为预防ND的标记疫苗的研制开发打下了很好的基础。Mebatsion等［24］研究发现，NP蛋白447～455位氨基酸是一个免疫显性表位，可以诱导动物机体产生针对该表位的抗体，而且这一区域的缺失并不影响病毒的增殖。根据这一特点，该研究组构建了缺失NP蛋白443～460位氨基酸的NDV，免疫实验动物后，受试动物不能产生针对此免疫显性表位区的抗体，这一方法同样可以将NDV疫苗免疫动物与自然感染动物区分开来。2009年Hu等［25］以VII强毒为骨架，通过PCR定点突变的方式，将其F0裂解位点突变为弱毒，并进行动物保护实验。结果发现在使用当前的VII流行毒株攻毒时，常用疫苗株LaSota虽能产生完全的临床保护，但并不能防止流行株在免疫鸡中的感染复制和排出。而使用VII型致弱疫苗株免疫组，不仅能提供理想的临床保护，而且能显著降低免疫鸡的强毒感染率和排毒量，在临床上可有效控制免疫鸡群中非典型ND的发生。

4.2以NDV为载体双价疫苗的最新研究进展 2015年Wang等［26］将NDV强毒NA-1株通过反向遗传平台致弱后，以其为载体构建了表达小鹅瘟病毒VP3基因的双价基因工程疫苗。他们将小鹅瘟病毒的VP3基因插入NDV基因组中P～M基因之间，获得了含有小鹅瘟病毒VP3基因的重组病毒rmNA-VP3。重组病毒鸡胚连续传10代后仍能稳定地表达VP3蛋白。动物实验显示重组病毒免疫后对小鹅无致病性，并能同时检测到针对NDV和小鹅瘟病毒VP3基因的高滴度抗体。Liu等［27］在2015年以NDV为载体，分别构建了插入了H5和H7 亚型禽流感病毒HA基因的双价活疫苗。插入前除在HA基因前添加GS和GE序列外，还在HA基因之后添加了NDV F基因胞质区和跨膜区蛋白的编码序列，并成功地拯救出了2株重组病毒。2株重组病毒免疫雏鸡后，分别使用H7N9和H5N1的强毒攻击，均能达到较高的保护率。Malli等［28］在2014年以NDV为载体构建了分别表达鸡喉气管气炎病毒gB、gC和gD基因的重组活疫苗。结果显示gD基因的表达效率最高且能较好地嵌入至NDV的囊膜表面。动物实验表明，免疫组能完全抵抗鸡喉气管气强毒和NDV强毒的联合攻击。几乎同时Zhao等［29］发表了以La Sota为骨架分别表达鸡喉气管气病毒gB 和gD基因的相关文章。他们构建的两株重组病毒均能以较高水平表达外源基因，且重组病毒的毒力、生长曲线等与La Sota自身相比差异无显著性统计学意义。动物实验表明，这两株重组病毒可以通过喷雾和饮水的方式使用，且对两种病毒都有较好的免疫保护效果。

综上所述，NDV的反向遗传技术已经越来越成熟，伴随着此项技术的成熟，不同特性的毒株被拯救，且对毒力的研究更加细致和全面。同时随着反向遗传学的快速发展，NDV作为疫苗载体有巨大的应用意义。

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RESEARCH PROGRESS ON REVERSE GENETICS IN NEWCASTLE DISEASE VIRUS

DAI Jian-hua1，2， GAO Song1

（1. College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225403， China； 2. Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300， China）

Newcastle disease virus （NDV） is an enveloped virus belonging to the genus Avulavirus within the family Paramyxoviridae which contains a single-stranded， negative-sense， non-segmented genome. Reverse genetics is an approach to discover the function of a gene by analyzing the phenotypic effects of specifi c engineered gene sequences. The advent of reverse genetics and molecular engineering of viruses have transformed the fi eld of virology by permitting study of targeted genetic changes in virus genomes. The technical progress in studying NDV virulence related genes by using the reverse genetic system was reviewed in the article.

Newcastle disease virus； reverse genetics； virulence； vector

S852.659.5

A

1674-6422（2016）04-0082-05

2016-03-16

国家自然科学基金青年基金（31400144）

戴建华，男，博士研究生，预防兽医学专业

高菘，E-mail：gsong@yzu.edu.cn