沙门菌减毒基因的研究进展①

陈松彪　张春杰　程相朝

(河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，洛阳471003)



沙门菌减毒基因的研究进展①

陈松彪张春杰程相朝

(河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，洛阳471003)

①本文为河南省科技攻关资助项目(162102110054)。

沙门菌(Salmonella)属于肠道致病菌，是一种重要的食物源性病原体，其具有广泛感染的宿主谱，在公共卫生方面具有重要的意义。用沙门菌作为重组疫苗的载体具有安全、免疫方式类似自然感染等无可比拟的优越性。弱毒的沙门菌活疫苗可以经口服途径表达传递重组的抗原到机体的黏膜表面，从而诱导机体产生保护性的免疫应答来对抗病原体的感染。近年来，出现的许多令人振奋的医学新发现和新技术都是以减毒的沙门菌作为载体来实现的。本文结合国内外近年来构建的一些沙门菌减毒菌株进行说明，为进一步研制安全高效的沙门菌弱毒疫苗以及将其用作活载体表达外源基因的研究奠定基础。

1　沙门菌的研究状况

沙门菌具有广泛感染的宿主谱，据估计，每年有8.0×105～3.7×106不等数量的人感染沙门菌[1]，该菌能引起食物中毒和医院内感染流行、暴发，在医学、兽医和公共卫生上具有十分重要的意义。

近年来，利用基因工程技术将强毒株毒力相关基因敲除构建新型减毒沙门菌作为疫苗的研究备受关注，采取基因工程方法减毒的沙门菌对人和动物的致病力显著降低，但仍然保持良好的安全性和免疫原性。最早通过抗生素诱导对鼠伤寒沙门菌进行减毒，但所获得的弱毒株毒力不稳定，因而应用起来不受欢迎，后来发展成为用化学诱变进行减毒，钱峰等[2]发现鼠伤寒沙门菌的Ty2株经诱变后可成为半乳糖差向异构酶(Galactose epimerase,galE)基因缺失的营养缺陷型突变株，此菌株已获准用于人体，但是由于用化学诱变产生突变株很盲目，可能存在其他未知突变，其背景不清楚且可能出现毒力回复等，若用于疫苗制备，其质量也不敢保证，所以此法也不被人们重视。

随着分子生物学技术的发展以及对沙门菌毒力遗传学的深入研究和了解，为该病原体在基因组中引入多重、限定、减毒和不可回复的突变提供了可能性。为克服最早用于预防沙门菌病的灭活疫苗只能激发体液免疫、不能提供交叉保护、容易引起全身及局部反应等缺陷，近年来人们通过基因工程方法构建沙门菌减毒或无毒活菌疫苗免疫动物取得了比较好的效果。利用基因工程方法在沙门菌染色体基因组上随机插入一个转座子或删除一段或几段毒力相关基因，使编码毒力因子或编码关键代谢途径的酶基因的序列发生改变，以及控制菌株在体内生存的调节基因等均可使其毒力降低，但仍保留着高度的免疫原性。因此，应用各种基因工程技术构建减毒沙门菌作为弱毒疫苗已成为研究热点。目前，许多与沙门菌致病相关的因子用于沙门菌的减毒，并已取得了不同程度的成功。

2　沙门菌毒力基因的研究概况

沙门菌的致病机理主要与位于Ⅲ型分泌系统上的编码毒力岛1(SPI-1)和毒力岛2(SPI-2)上的一些毒力因子有关，Ⅲ型分泌系统在细菌进入宿主细胞中起着重要作用，这些蛋白被称之为效应蛋白，SPI-1上面的蛋白主要促进细菌黏附并进入宿主细胞，并且与细胞内的炎症发生有关，SPI-2上面的蛋白主要与细菌感染宿主细胞并在吞噬细胞内存活和复制有关，由SPI-1和SPI-2上面的蛋白共同发生作用，从而引起全身性感染。目前许多研究者已经利用沙门菌致病岛SPI-1、SPI-2、SPI-3上面与毒力有关的致病因子进行了一系列的研究[3]。在沙门菌感染机体的过程中，SPI-1负责细菌对宿主的初期侵入，SPI-2对于细菌在吞噬细胞内的生存是至关重要的。SPI-3致病岛与鼠伤寒沙门菌繁殖和持续作用于肠黏膜有关。下面就位于毒力岛上面一些减毒基因的国内外近年的研究现状进行阐述。

2.1cya基因cya基因编码环化腺苷酸合成酶，该类减毒株能有效刺激机体产生黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，李静等[4]通过重组自杀性质粒介导的细菌同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统，生物学特性结果表明其毒力较亲本菌株相比降低了104倍，免疫雏鸡后对100LD50的野毒攻击有60%左右的免疫保护率，有潜力开发为疫苗活载体。

2.2rpoE基因Rpo蛋白是目前研究最多的δ因子，它在稳定生长期受到环境应激时控制着基因表达，缺少rpoE基因可导致沙门菌对环境的抵抗力下降，生物被膜形成能力下降，黄骏等[5]通过RED重组方法构建鸡白痢沙门菌rpoE基因缺失株，生物学特性结果表明rpoE基因缺失株呈粉色干燥粗糙型，且荧光板的荧光强，说明产生纤维素，但不产生卷曲菌毛，且对环境的抵抗力发生了下降。

2.3ygaE基因最早在大肠杆菌中报道，在大肠杆菌中，gabC(来源于ygaE)被报道其属于gabDAPC操纵子，是操纵子的抑制剂[6]，gab操纵子的功能主要与λ-氨基丁酸的分解代谢有关，但是不能分解代谢其他的氮源物质[6]，然而对于ygaE基因在沙门菌中研究甚少，Schneider等[7]报道该基因能够控制外膜蛋白OmpF/OmpC在高渗压力下的早期阶段和OmpA外膜蛋白的在高渗压力下的后期阶段。

2.4steA基因该基因是为数不多充当Ⅲ型分泌系统的基底之一，它位于SPI-1(毒力岛1)和SPI-2(毒力岛2)之间，Cardenal等[8]使用缺失该菌株的肠炎沙门菌去感染HeLa细胞发现会影响细胞外基质的生物合成，调节细胞增殖，并且能够影响丝氨酸/苏氨酸激酶的信号通路。同时也能够抑制与免疫相关基因的表达和调控嘌呤核苷酸的形成，并且与SMAD蛋白磷酸化的信号通路有关。

2.5sipB基因该基因是位于Ⅲ型分泌系统SPI-1上的一种效应蛋白，主要与细菌的侵袭力有关，同时也与细胞的耐高渗有关，Hiroshi等[9]发现鼠伤寒沙门菌LT2菌株的sipB基因缺失会显著降低菌株的耐高渗性，生化特性试验表明NaCl的等渗溶液能够增加sipB缺失菌株细胞膜的膜拓扑异构，亲本菌株在渗透压力的条件下能够提高环丙烷脂肪酸的利用，另一方面有越来越多的证据表明SipB蛋白通路Caspase-1介导的通路激活IL-1b和IL-18来引起巨噬细胞的坏死和凋亡[10,11]。

2.6flgC基因该基因是构成细菌鞭毛基底部的一个成分，Shippy等[12]采用转座子的方法构建出鼠伤寒沙门菌E2627 株flgC基因缺失菌株，生物学特性表明该缺失菌株生长速度较亲本菌株和回复菌株相差不大，但其运动型发生了显著的降低，对肠上皮细胞的侵入试验表明该缺失菌株侵袭性发生了明显的降低，进一步在鸡体内的动态分布试验也显示肝脏和脾脏中细菌数目也发生了显著的降低。以上结果表明该基因在沙门菌感染家禽入侵肠黏膜方面发挥着重要的作用。

2.7stdA基因Shippy等[13]通过转座子的方式构建出肠炎沙门菌stdA基因缺失菌株，并将缺失菌株与亲本菌株进行了生物学特性的比较，结果表明缺失株的生长速度与亲本菌株相差不大，但是运动性较亲本菌株相比发生了显著的降低，通过体内和体外试验进行了侵袭性的检测，结果与flgC突变株的结果相类似，对肠上皮细胞的侵入降低，动物试验结果表明在小肠和盲肠细菌数均低于亲本菌株组，在肝脏和脾脏上的细菌数也显著低于亲本菌株。

2.8sefA基因主要编码SEF14亚单位菌毛，Zhu等[14]使用同组自杀性质粒介导的细菌同源重组技术构建了sefA的缺失菌株，证实了该基因在SEF14菌毛体外和体内的致病过程中所扮演的重要角色，与亲本菌株50336相比sefA基因缺失菌株能够提高小鼠腹腔巨噬细胞的存活，6周龄的BALB/c毒力实验结果表明缺失株的LD50明显升高。

2.9yncD基因主要编码外膜上依赖TonB的转运体，Xiong等[15]使用重组自杀性质粒介导的细菌等位基因同源重组技术构建出yncD基因缺失菌株，通过腹腔接种小鼠进行毒力测定，发现其毒力较亲本菌株相比发生了显著降低，免疫保护效力实验结果显示对104和105CFU的野毒攻击能提供100%的保护率。

2.10aceE基因该基因主要编码丙酮酸脱氢酶，Pang等[16]使用转座子插入的方法构建出肠炎沙门菌aceE基因缺失菌株，生物学特性研究表明该缺失菌株对肠上皮细胞的侵袭性降低，动物感染试验表明缺失株对鸡的毒力发生下降，完全致死剂量的野毒攻毒有50%的免疫保护率。

2.11ompR基因ompR基因主要与细菌的生物被膜形成有关，该基因缺失后会影响细菌生物被膜的形成，已有研究表明该基因还与细菌的毒力有一定的关系，缺失该基因后对小鼠的毒力会发生显著的下降[17,18]，该基因缺失后仍能够产生很高的IgG和IgA抗体，Dong等[19]发现肠炎沙门菌C50041缺失此基因后对野毒攻毒有62.5%的免疫保护率[19]。

2.12spiA 基因spiA基因参与沙门菌生物被膜的形成，董洪燕等[17]报道spiA基因是通过降低卷曲菌毛来调控肠炎沙门氏菌生物被膜的形成。spiA基因缺失株以及野生株的半数致死量为107.47和10.03，以100倍LD50野生株攻毒后spiA基因缺失突变株仍能保持50%的免疫保护效力。说明spiA基因缺失后通过影响细菌生物被膜的形成来达到减毒的目的。

2.13tpi基因该基因主要编码糖酵解代谢过程中的磷酸丙糖异构酶，主要通过影响和改变细菌的形态，从而影响其在动物体内的增殖来达到减毒的目的，Gavin等[20]通过λRed重组系统，以鼠伤寒沙门菌SL1344为研究对象，构建出了tpi基因的缺失菌株，并且利用原核载体pBR322构建出缺失菌株的回复菌株，结果表明缺失该基因后菌株的某些生化特性发生了改变，并且形态较亲本菌株相比也发生了变化，生长速度降低，在小鼠体内动态分布试验表明在肝脏和脾脏的侵袭力均发生了下降，免疫105CFU的缺失菌株后能有效抵御野毒株的感染。

2.14spiC基因该基因编码的效应蛋白在避免吞噬小泡与溶酶体融合机制中发挥极其重要的作用，有利于沙门菌在宿主巨噬细胞中的存活，SpiC效应蛋白还能参与调控其他效应蛋白的分泌，spiC基因缺失后导致细菌毒力下降。耿士忠等[21]构建了鸡白痢沙门菌spiC基因缺失菌株，生物学特性研究表明，该缺失菌株生化特性仍和亲本菌株保持一致，生长速度略慢于亲本菌株，对雏鸡的毒力实验显示spiC突变株对雏鸡的半数致死量比野生株提高了约154倍，毒力明显下降，这为后期研究其作为减毒鸡白痢沙门菌活疫苗的可能性奠定了重要基础。

3　展望

以减毒沙门菌作为载体表达外源蛋白已成为当今学者研究的一个热点，它可以作为增强机体免疫力的一种方法，通过口服免疫使机体获得持久的黏膜、体液和细胞免疫应答，通过将同一种病原体的主要保护性抗原基因在弱毒的沙门菌体内复制和表达，从而能够以较小的免疫剂量来抵抗致病菌的感染，这种途径相当有效。重组的减毒沙门菌表达异源性抗原基因，然后机体经口服摄入，诱发机体的免疫应答来对抗由这些入侵体内特定的病原体。与其他的细菌，如大肠杆菌，李斯特菌、志贺菌和弧菌相比，沙门菌侵袭的特性使它能轻易地诱发B细胞和记忆T细胞的免疫应答，这些给了沙门菌能够长期诱导机体持续的免疫应答的潜能。

沙门菌是最早应用于活疫苗载体的病原菌之一，也是研究最深入的活菌疫苗载体，已经在防治多种疾病上显示出了良好的应用前景，但仍存在一些问题，如毒力返强、外源基因表达不如预期稳定、质粒DNA的危险性、宿主对抗原免疫应答的负载能力不一等。目前对于沙门菌研究是一个热点，很多沙门菌的二联苗被广泛的开发[22-24]。因此，通过对沙门菌毒力基因的深入研究，可为研制一个遗传背景清晰、安全有效的沙门菌口服疫苗弱毒株，进一步将其开发为适于黏膜免疫的口服多价疫苗载体提供新的思路。今后的目标是开发更有优势的技术来进一步完善沙门菌载体技术，为活菌载体技术和疫苗研发工作带来新的契机。

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[收稿2015-07-20修回2015-08-04]

(编辑倪鹏)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.036

S852.612文献标志码A

1000-484X(2016)08-1241-04

陈松彪(1990年-)，男，硕士，主要从事人畜共患病的诊断和防治的研究，E-mail:chensongbiao@126.com。

及指导教师：张春杰(1964年-)，女，博士，教授，主要从事动物疫病防控和分子免疫学方面的研究，E-mail:cjzhang@sina.com。