中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA分型及与疾病进展分析①

孙坚萍　孙焕芹　刘　宁　刘桂海　丛　佳　张永宏

(首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069)



·临床免疫学·

中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA分型及与疾病进展分析①

孙坚萍孙焕芹刘宁刘桂海丛佳②张永宏③

(首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069)

①本文为国家十二五传染病重大专项(2012ZX10001006-001-008,2013ZX10001004-001-002)、北京市科委(D131100005313004，D131100005313005，D141100000314005和D141100000314002)。

②首都医科大学附属北京同仁医院血液科，北京100730。

目的：分析中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C基因频率以及HLA基因分型与疾病进展关系。方法：序列特异性引物的PCR扩增(PCR-sequence specific primer typing,PCR-SSP)对310名随机中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C基因进行分型,采用HIV Molecular Immunology Database中HLA Analysis Tools方法计算等位基因频率。结果：在北京男男同性恋艾滋病感染者队列中，HLA-A*1101(34.52%)基因频率最高，其次为HLA-A*0201(31.94%)、HLA-C*0102(27.10%)以及HLA-A*2402(26.45%)。根据艾滋病感染者1年内CD4细胞计数变化来判断感染者是否为快速进展者，结果发现快速进展者134例，非快速进展者176例。快速进展者中存在低水平的HLA-B*4403(快速进展者1.12%，非快速进展者为4.27%,P=0.0276)，HLA-B*1511(非快速进展者5.98%,快速进展者2.25%,P=0.0282),HLA-B*5701(非快速进展者2.56%,快速进展者0.37%,P=0.0491)表达，而HLA-C*0304则在快速进展者中高表达(非快速进展者4.56%,快速进展者8.96%,P=0.0319)。结论：本研究获得了中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、 HLA-B、HLA-C基因的等位基因分布频率数据，并发现HLA-B*4403、HLA-B*1511、HLA-B*5701与延缓艾滋病疾病进展有关，而HLA-C*0304则与加速艾滋病疾病进展相关。

HIV;人类白细胞抗原;男男同性恋

尽管国内外对艾滋病已经研究了很多年，但是艾滋病依然是国际上最严重的传染病之一。根据疾控部门权威数据统计，目前性传播已成为中国艾滋病传播主要途径，其中男男性行为者(Men who have sex with men,MSM)是我国当前艾滋病新发感染的主体人群[1,2]。如何控制MSM人群的HIV传播风险关系到我国艾滋病防治工作的成败。艾滋病感染的发生发展除了与HIV(Human Immunodeficiency Virus,HIV)病毒本身的病原学特征有关外，还与机体的遗传基因、免疫因素密切相关。其中人类白细胞抗原(Human leucocyte antigen,HLA)是人类最重要的免疫遗传基因和器官移植免疫基因,与艾滋病病毒感染密切相关。

HLA定位于第6对染色体短臂(6p21.31)，按基因产物和功能不同可分为HLA-Ⅰ类(包括HLA-A、HLA-B和HLA-C)； HLA-Ⅱ类(包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)；HLA-Ⅲ类(包括补体分子、肿瘤坏死因子等)[3]。艾滋病是少数几个与HLA明确相关的感染性疾病，已有很多研究报道HLA分型和艾滋病疾病进展相关。如HLA-B*58与非洲大陆人种的HIV-1感染性相关[4]。HLA-B*57是一个潜在的与HIV不易感性密切相关的多态性位点[5]。HLA-B*27和 HLA-B*57在白种人群中与延缓疾病进展相关[6,7]。在本研究中，我们主要对中国北京男男同性恋艾滋病感染者的HLA等位基因分型进行分析，并探讨HLA等位基因分型和男男同性恋艾滋病感染者疾病进展间的相关关系。

HLA基因分型技术随着分子生物学方法的快速进展也得到了进一步发展。原先属于同一个血清学特异性的抗原往往可被数个甚至数十个不同的等位基因所编码，表明同一个特异性的HLA抗原实际上由多个亚型组成。其中基于DNA测序的方法能够比较全面的描述HLA基因的复杂性和多样性。具体方法包括PCR产物的序列特异寡核苷酸探针杂交(PCR-sequence specific oligonucleotide hybridization typing,PCR-SSO)、序列特异性引物的PCR扩增(PCR-sequence specific primer typing,PCR-SSP)和序列直接分型(PCR-sequencing based typing,PCR-SBT)。基于DNA测序结果发现编码HLA-A2抗原的等位基因数已经超过100个；编码HLA-DR4的等位基因也至少有36个。DNA测序结果对某一个等位基因，先写出座位名，下接*号，再用4个数字代表这个等位基因的名字。例如B*2707、DRB1*0405、DQB1*0301等。*号后面的4位数中前两位是指这个等位基因相应的血清学特异性；后两位数则代表该等位基因序号。在本研究中，我们对HLA等位基因进行了4位数字的分析。

我们利用PCR-SSP方法对中国北京MSM人群进行了HLA-Ⅰ类(包括HLA-A、HLA-B、HLA-C)分型，并进一步分析HLA分型和艾滋病感染者疾病进展间的相关关系。

1　材料与方法

1.1研究对象根据知情同意原则，在首都医科大学附属北京佑安医院收集HIV-1阳性男男同性恋感染者310例(随访时间为2007年～2014年)。全部感染者均为男性，年龄为18～60岁，平均(31.2±6.9)岁，民族主要为汉族，其他民族包括满族、回族、朝鲜族、蒙族、蒙古族、苗族，均未接受抗病毒治疗。全部感染者均经Western印迹试验确认阳性。EDTA抗凝管采集感染者外周静脉血，6 h内常规离心分离血浆和全血，分装后-80℃冻存备用。

1.2人基因组DNA提取采用QIAamp DNA Blood mini Kit(德国Qiagen公司)从200 μl全血中提取人基因组DNA，具体按照试剂盒说明书进行。DNA溶于50 μl无DNA酶及RNA酶的水中，-20℃冻存备用。

1.2.1HLA等位基因型测定采用PCR方法对目的片段进行扩增,扩增用的DNA 聚合酶，LA Taq DNA聚合酶等试剂购自TaKaRa公司。引物根据NCBI中人类HLA-A、B、C三个基因的序列，分别设计合成引物用于扩增上述三个基因的这三个外显子(exon2、3、4)的全长序列。HLA-C扩增不容易成功，又补充设计合成了一对引物，用于扩增HLA-C位点全长序列。PCR循环结束后取PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。检测有目的条带的样品，切胶纯化后使用双向引物进行测序,每个位点对应的双向测序结果用ChromasPro软件进行分析，确定杂合位点，然后导入IMGT/HLA database(http://www.ebi.ac.uk/imat/hla/)确定每个位点对应的基因型(委托北京诺赛有限公司)。引物序列见表1。1.2.2HLA等位基因型分析应用HIV Molecular Immunology Database中HLA Analysis Tools(http：//www.hiv.lanl.gov/content/immuno-logy/to-ols-links.ht ml)进行HLA等位基因频率分析及组间对比分析。

1.2.3感染者CD4/CD8细胞计数常规检测感染者不同时间点的CD3/CD4/CD8绝对计数，检测采用TriTEST三色试剂(BD Company,FranklinLakes,New Jersey,USA)进行检测，用MultiSET软件进行分析。组间比较采用非配对t检验进行统计学分析(ttests，GraphPad Prism 6)。

表1　扩增HLA-A、B、C目的片段的引物序列和扩增片段长度Tab.1　Sequence of PCR primer for HLA-A,B,C

2　结果

2.1HLA等位基因型频率本研究在310例艾滋病感染者中共检出29种HLA-A等位基因，48种HLA-B等位基因和25种HLA-C等位基因(图1)。在HLA-A等位基因中，HLA-A*1101(34.52%)基因频率最高，其次为HLA-A*0201(31.94%)、HLA-A*2402(26.45%)。基因频率最高的HLA-B等位基因型为HLA-B*4001(15.16%)，其次为HLA-B*1501(14.84%)，HLA-B*4601(14.84%)。HLA-C等位基因中HLA-C*0102频率最高(27.10%)，其次为HLA-C*0303(22.90%)、HLA-C*0702(22.26%)。本研究中，等位基因频率超过10%的HLA等位基因型由高到低的顺序分别为HLA-A*1101、HLA-A*0201、HLA-C*0102、HLA-A*2402、HLA-C*0303、HLA-C*0702、HLA-C*0602、HLA-B*4001、HLA-C*0801、HLA-B*1501、HLA-B*4601、HLA-C*0304、HLA-B*5101、HLA-C*1402、HLA-A*0206、HLA-B*3501、HLA-A*0207、HLA-C*0401、HLA-B*1302(表2)。

2.2艾滋病感染者疾病进展分组对男男同性恋高危人群进行随访，在艾滋病抗体检测阳性后继续对感染者进行随访，根据随访者的CD4计数进行疾病进展判断，快速进展者为接受抗病毒治疗时CD4计数低于350个/μl，或感染者在检测阳性后1年内CD4计数低于350个/μl[8]。在本研究中，310例感染者分为两组，一组为快速进展者(n=134例,平均年龄30.77±7.73岁)，另一组为非快速进展者[n=176例，平均年龄(31.88±7.99)岁]，两组间平均年龄不存在统计学差异(P>0.05)。比较两组间阳性时的CD4细胞计数，结果见图2，两组间检测阳性时CD4细胞计数存在显著差异(快速进展者313.5个/μl±12.06，非快速进展者521.3个/μl±15.44，P<0.0001)。比较两组间阳性时CD8细胞计数，结果发现CD8细胞计数快速进展组虽然高于非快速进展者，但是两者之间不存在统计学差异(快速进展者1 188个/μl±65.76，非快速进展者1 153个/μl±56.37，P=0.702 6)。

图1　中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA分型频率Fig.1　Frequency of HLA in MSM cohort

表2　HLA基因分型在男男同性恋艾滋病感染者人群中的分布频率Tab.2　HLA allelic frequencies and population frequencies in MSM cohort

图2　快速进展组和非快速进展组CD4/CD8细胞计数比较(mann-whitney test)Fig.2　Compare CD4 T cell counts and CD8 T cell counts in rapid progressors and nonprogressors(mann-whitney test)

图3　快速进展组和非快速进展组HLA分型频率比较Fig.3　Compare HLA frequencies in rapid progressors and nonprogressorsNote: Population 1 is nonprogressors and population 2 is rapid prognessors by HIV.

2.3HLA基因分型和艾滋病疾病进展利用HIV Molecular Immunology Database对快速进展者和非快速进展者的HLA基因分型表达频率进行比较。结果发现在快速进展组，HLA基因分型主要为HLA-A*1101(20.90%)、HLA-A*0201(16.04%)、HLA-C*0102(16.04%)、HLA-A*2402(15.67%)；在非快速进展组中，HLA分型主要为HLA-A*0201(18.75%)、HLA-A*1101(18.18%)、HLA-C*0602(13.68%)、HLA-A*2402(13.64%)。比较快速进展组和非快速进展组的HLA分型表达频率差异，结果发现在这两组中存在四种HLA分型表达差异(图3)，包括HLA-B*4403(非快速进展者为4.27%,快速进展者1.12%,P=0.027 6)，HLA-B*1511(非快速进展者5.98%,快速进展者2.25%,P=0.028 2),C*0304(非快速进展者4.56%,快速进展者8.96,P=0.031 9),B*5701(非快速进展者2.56%,快速进展者0.37%,P=0.049 1)。

3　讨论

研究报道在艾滋病感染的三种途径中，母婴传播、血液传播(特别是静脉注射传播)得到有效控制的同时，性途径的传播并未得到有效遏制，其中男男性接触人群中的艾滋病(Men sex with men，MSM)疫情正在迅速蔓延，男男同性恋在北京市HIV感染者中的比例也在逐年上升[1,2]。

人白细胞抗原系统的高度多态性显示了遗传背景的多样性，在我们前期研究中发现在中国中部SM队列(90年代经静脉采血途径感染艾滋病的感染者队列)中，HLA分布为HLA-A02(52%)、HLA-A11(25%)、HLA-A24(29%)、HLA-A30(20%)、HLA-B40(26%)、HLA-C03(32%)、HLA-C07(29%)、HLA-C06(28%)、HLA-C08(22%)和HLA-C01(19%)。而在本研究中，我们采用PCR-SSP方法对MSM感染者进行了更为精确的4位HLA分型分析。结果发现在MSM队列中HLA-A*1101(34.52%)基因频率最高，其次为HLA-A*0201(31.94%)、HLA-A*2402(26.45%)。基因频率最高的HLA-B等位基因型为HLA-B*4001(15.16%)，其次为HLA-B*1501(14.84%)、HLA-B*4601(14.84%)，HLA-C中HLA-C*0102频率最高(27.10%)，其次为HLA-C*0303(22.90%)、HLA-C*0702(22.26%)。这些结果提示在不同的艾滋病感染者中，由于区域的不同导致了艾滋病感染者HLA分型的不同，我们的结果为了解不同区域艾滋病感染者的HLA分型提供了更精确的数据。

根据感染者CD4细胞计数的随访结果，310例MSM艾滋病感染者分为两组，比较这两组的HLA基因分型我们发现，HLA-B*4403(非快速进展者为4.27%,快速进展者1.12%,P=0.027 6)，HLA-B*1511(非快速进展者5.98%,快速进展者2.25%,P=0.028 2),HLA-B*5701(非快速进展者2.56%,快速进展者0.37%,P=0.049 1)与艾滋病疾病的延缓相关，而HLA-C*0304则与加速艾滋病疾病进展相关(非快速进展者4.56%,快速进展者8.96,P=0.031 9)。有文献报道HLA-B等位基因在所有HLA中最具有多态性(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla),因此对HIV感染的结局有很大的影响。大量研究显示HIV感染者CD8+T细胞对HIV的反应受到HLA-B的制约，并且病毒载量的变化与HLA-B基因多态性有关[9]。其中HLA-B27、HLA-B57和HLA-B35是研究的较为明确与HIV进展关系密切的HLA-B等位基因[4-7,10]。在我们的研究中，也显示主要是HLA-B等位基因(HLA-B*4403、HLA-B*1511和HLA-B*5701)和艾滋病疾病进展相关。

此外，我们前期研究发现在SM队列中有17.90%的感染者为HLA-B51阳性，明显高于普通

中国人群中HLA-B51的百分率[11]。另外，在HLA-B51阳性的HIV-1 患者中其病毒载量明显低于HLA-B51阴性患者，提示在该研究队列中HLA-B51与延缓HIV-1疾病病情进展密切相关[12]。在本研究中，我们发现MSM感染者中HLA-B51的阳性率为12.58%。根据本研究结果，更精确分析发现HLA-B*5101占主要部分(12.26%)而HLA-B*5102只占0.97%。而且根据CD4细胞计数来判断艾滋病疾病进展时，未发现HLA-B51(HLA-B*5101或HLA-B*5102)与MSM感染者的艾滋病疾病进展相关。原因可能包括：①艾滋病感染者所处区域的不同：SM队列为中国中部地区，而MSM队列为中国北京；②艾滋病感染者感染时间不同：SM队列为长期感染不进展者，感染HIV时间长，而MSM队列为HIV病毒抗体检测阳性后随访1年。

本研究主要对中国北京MSM感染者进行了4位数字的HLA等位基因分型分析，并初步探讨了HLA等位基因分型和艾滋病疾病进展间的相关关系，该研究结果为科学控制MSM感染者艾滋病疾病的进展提供了基础和依据。

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[收稿2015-11-19修回2015-12-11]

(编辑倪鹏)

Frequency of HLA gene in MSM cohort and correlation with AIDS disease progression

SUN Jian-Ping,SUN Huan-Qin,LIU Ning,LIU Gui-Hai,CONG Jia,ZHANG Yong-Hong.Beijing Youan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069，China

Objective:HIV-1 infection was associated with a variety of host genetic factors,and HLA was one of the factors that contribute to the progression of disease.We analyze the frequency of HLA-A,HLA-B,HLA-C in MSM cohort,and the relationship between HLA gene with disease progression.Methods: PCR-sequence specific primer typing HLA typing was used to detect the allele frequency of HLA gene in 310 patients.HIV Molecular Immunology Database(HLA Analysis Tools)to analysis the frequency of HLA.Results: In MSM cohort,HLA-A*1101(34.52%) gene was the highest,followed by HLA-A*0201(31.94%),HLA-C*0102(27.10%) and HLA-A*2402(26.45%).According to the CD4 cell count of HIV infected patients,the results showed that there were low levels of HLA-B*4403(1.12%,P=0.0276),HLA-B*1511(2.25%,P=0.0282) and HLA-B*5701(0.37%,P=0.0491) in rapid progressors,while the HLA-C*0304(8.96%,P=0.0319) was higher than that of nonprogressors(4.56%).Conclusion: We obtained the distribution frequency data of HLA-A,HLA-B and HLA-C in MSM cohort.Our data presented here may offer potential correlation between dominant effect of HLA alleles and HIV-1 disease progression.And found that the HLA-B*4403,HLA-B*1511,HLA-B*5701 related to slow HIV disease progression and HLA-C*0304 related to accelerate HIV disease progression.

HIV;HLA;Men who have sex with men

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.022

R512.91文献标志码A

1000-484X(2016)08-1183-05

③，E-mail:13810108505@163.com。

孙坚萍(1977年-)，女，博士，副研究员，主要从事病毒免疫学方面研究。