肾透明细胞癌中DNMT1和HDAC1表达相关性研究

田志辉，倪晓辰，李　芳，殷凤朝，马永良，张爱莉



肾透明细胞癌中DNMT1和HDAC1表达相关性研究

田志辉，倪晓辰，李芳，殷凤朝，马永良，张爱莉

[摘要]目的通过检测DNA甲基化转移酶1(DNMT1)和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在肾透明细胞癌(RCCC)组织及癌旁组织中的蛋白表达情况，探讨其与RCCC发生、发展及生物学行为相关性。方法采用免疫组织化学S-P法分别检测114例RCCC组织、50例癌旁组织中DNMT1和HDAC1蛋白表达情况,并分析其表达水平与临床病理特征的关系。结果DNMT1蛋白在RCCC中的阳性率(71.93%)明显高于癌旁组织(24.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)；HDAC1蛋白在RCCC中的阳性率(59.65%)高于癌旁组织(38.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)。DNMT1及HDAC1蛋白在RCCC中的表达与Fuhrman分级及临床病理分期相关(P<0.01)，而与性别、年龄、肿瘤大小及淋巴结转移情况无关(P>0.05)。相关性检验结果显示：DNMT1与HDAC1蛋白表达呈正相关(rspan=0.282，P=0.034)。结论DNMT1和HDAC1可能参与了RCCC的发生、发展，并有协同作用。

[关键词]肾透明细胞癌；DNA甲基化转移酶1；组蛋白去乙酰化酶1；免疫组织化学

肾透明细胞癌(RCCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤，普遍认为其发生是多步骤与多基因共同作用的结果，其中包括抑癌基因失活、癌基因过表达[1-4]。在调控基因表达过程中，RCCC发生与表观遗传学(包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA调控等修饰)关系密切。DNA甲基化转移酶1(DNMT1)可以引起肿瘤细胞的生长抑制、凋亡增加伴有DNA甲基化改变，也是在体细胞中最丰富的甲基转移酶。组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在多种肿瘤中过表达，对肿瘤的增殖和进展起到重要作用[5-11]。本实验通过研究DNMT1和HDAC1在RCCC中的表达情况，揭示其在RCCC发生、发展过程中的作用机制，以期为临床靶向药物的开发提供前瞻性研究。

1材料与方法

1.1标本来源随机选取河北医科大学第四医院泌尿外科2011年1月—2012年12月肾癌根治术后标本114例。术后标本及时置于10%中性福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋，4 μm的连续切片4张备用。所有标本均经病理科诊断证实为RCCC，共114例，其中男66例，女48例，年龄21~82岁，平均年龄59.7岁。有淋巴结转移36例，Fuhrman分级1级26例，2级40例，3级36例，4级12例，临床病理分期I期+Ⅱ期:76例，Ⅲ期+Ⅳ期:38例。所有患者术前均未行放、化疗及生物免疫治疗,且无其他肿瘤病史。同时取50例癌旁肾组织(距离大于肿瘤边缘2 cm)作对照。

1.2主要实验制剂DNMT1、HDAC1多克隆抗体(上海吉泰生物科技有限公司)，苏木素、伊红(上海生物工程科技有限公司)，SP免疫组化试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.3实验方法采用链霉菌蛋白-过氧化物复合物(S-P)法，具体步骤按试剂盒说明书进行。每次染色均设阴性及阳性对照，选用已知阳性组织做阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗。

1.4免疫组化结果判定DNMT1和HDAC1阳性染色部位为细胞质或细胞核的棕黄色颗粒,采用双盲法,随机选择10个高倍视野(400倍)，每个高倍视野下计数100个肿瘤细胞。观察阳性细胞所占的百分数和染色强度。对阳性细胞所占百分比记分(标准为：≤5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分)，染色强度(标准为：无色=0分，淡黄色=1分，棕黄色=2分，深棕色=3分)，两者计分相加：0分为(-)，1~2分为(+)，3~4分为(++)，5~7分(+++)。

1.5统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计数资料采用χ2检验，相关性检验采用Spearman相关分析，α=0.05为检验水准。

2结果

2.1DNMT1及HDAC1蛋白在RCCC组织、癌旁组织中的表达DNMT1蛋白在RCCC组织、癌旁组织的阳性表达率分别为71.93%(82/114)、24.00%(12/50)，差异有统计学意义(χ2=21.89，P<0.001)；HDAC1蛋白在RCCC组织、癌旁组织的阳性表达率分别为59.65%(68/114)、38.00%(19/50)，差异有统计学意义(χ2=6.54，P=0.012)。其病理切片见图1、2。

图1　RCCC中DNMT1蛋白的表达(SP×200)图2　RCCC中HDAC1蛋白的表达(SP×200)DNMT1为DNA甲基化转移酶1，HDAC1为组蛋白去乙酰化酶1，RCCC为肾透明细胞癌

2.2DNMT1及HDAC1在RCCC中的表达与临床病理参数的关系DNMT1、HDAC1在RCCC中表达与年龄、性别、肿瘤大小及淋巴结转移情况无关(P>0.05)，与组织学分级及临床病理分期相关(P<0.01)。见表1。

2.3DNMT1和HDAC1蛋白表达的关系RCCC标本中，DNMT1、HDAC1表达均阳性共56例,均阴性共20例。DNMT1阳性而HDAC1阴性26例,HDAC1阳性而DNMT1阴性12例，相关性检验结果：HDAC1及DNMT1在RCCC中的表达呈正相关，Spearman相关系数(rs=0.282，P=0.034)。

3讨论

随着遗传学研究不断深入发展,表观遗传学应运而生,且表观遗传修饰与多种肿瘤发生发展相关[12-13]。表观遗传学包含4个步骤：DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体重塑和RNA相关沉默。研究发现，在一些人类基因组当中，DNA甲基化水平总特征是局部高甲基化和广泛低甲基化共存。而甲基转移酶活性增加是所有转化细胞的特征之一，甲基转移酶活性增加能诱导细胞转化。启动子区DNA甲基化与组蛋白去乙酰化之间具有协同抑制基因转录的作用，主要体现在：DNA过甲基化可能是基因转录抑制程序的直接启动者，而过乙酰化修饰则是抑制程序的执行者[5，14]。

DNMTs家族中主要有DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b四种蛋白，DNMT1可以引起肿瘤细胞的生长抑制、凋亡增加伴有DNA甲基化改变，也是在体细胞中最丰富的甲基转移酶，被认为是主要的具有维持甲基化作用的酶[5]，研究发现DNMT1在多种恶性肿瘤中呈高表达：在肺癌中过高表达与患者较差的预后密切相关；在膀胱癌中高表达与组织分化明显相关；在肝细胞癌中的高表达与其预后、恶性程度存在明显相关[15-18]。DNA启动子区异常甲基化总是伴随着DNA甲基化酶1(DNMT1)的异常表达[19-20]。DNMT1的活性增加被认为是肿瘤发生的启动事件[21]。

表1　DNMT1和HDAC1在RCCC中的表达及与临床病理参数之间的关系

HDAC1是1996年由美国哈佛大学Taunton实验室发现的第一个哺乳动物的HDAC，基因全长约41 kb，蛋白由482个氨基酸组成，相对分子量约55 kD[22]。目前已证实，HDAC1通过调节组蛋白和非组蛋白的蛋白质去乙酰化参与细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡调控，可能是哺乳动物基因转录的关键调节子[23-25]。HDAC1的表达可能与多种肿瘤如胃癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌等的进展有关。HDAC1高表达明显增加肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，且其表达水平亦受调节细胞周期、分化和增殖的转录因子和高细胞密度的影响[23]。DNA甲基化异常引发的肿瘤中，HDAC1同样也发挥着重要作用[26]。

本研究应用免疫组织化学SP法检测RCCC及癌旁组织中DNMT1、HDAC1的表达情况，结果显示：DNMT1、HDAC1蛋白在RCCC中的阳性率明显高于癌旁组织，提示两者可能参与了RCCC的发生、发展。二者相关性检验结果提示两者可能发挥了协同作用。

通过本项实验结果，可预测DNMT1、HDAC1作为诊断RCCC的分子标记，但仍需进一步研究两者在RCCC发生发展中发挥作用的分子机制，为临床靶向药物的开发提供实验基础。

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(收稿时间：2015-09-21修回时间：2015-10-26)

·论著·

A Correlation Study between DNMT1 and HDAC1 Expression in Renal Clear Cell Carcinoma

TIAN Zhi-hui1a, NI Xiao-chen1b, LI Fang1c, YIN Feng-chao2, MA Yong-liang1b, ZHANG Ai-li1b(a. Department of Computer Tomography, b. Department of Urinary Surgery, c. Department of Pathology, the Fourth Hospital Affiliated to Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China; 2. Department of Urinary Surgery, the First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the DNA methylation transferase1 (DNMT1) and histone deacetyltransferase1 (HDAC1) expressions in tissues and peritumoral tissues of renal clear cell carcinoma (RCCC) so as to investigate the correlation between the expressions and pathogenesy, development and biological behavior in RCCC. MethodsImmunohistochemistry method was used to detect the DNMT1 and HDAC1 expression in 114 cases of RCCC tissues and 50 cases of peritumoral tissues, and then the correlation between the expressions and clinical pathologic characteristics was analyzed. ResultsThe positive rate of DNMT1 in RCCC tissues (71.93%) was significantly higher than 24.00% in the peritumoral tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05). The positive rate of HDAC1 in RCCC tissues (59.65%) was higher than 38.00% in peritumoral tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05). The DNMT1 and HDAC1 expressions were correlated with Fuhrman classification and clinical pathological stage (P<0.01), but the expressions was not related with the gender, age, tumor size and lymph node metastasis (P>0.05). The DNMT1 expression was positively correlated with HDAC1 expression (rspan=0.282， P=0.034). ConclusionThe DNMT1 and HDAC1 protein may participate in the pathogenesy and development of RCCC with synergistic effect.

[Key words]Renal clear cell carcinoma; DNA methylation transferase1; Histone deacetyltransferase1; Immunohistochemistry

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.013

[文献标志码][中国图书资料分类号]R737.11 R392.12A

[文章编号]2095-140X(2015)12-0059-04

[通讯作者]张爱莉，E-mail:lifang198308@163.com

[基金项目][作者单位]050011石家庄，河北医科大学第四医院CT室(田志辉)，泌尿外科(倪晓辰、马永良、张爱莉)，病理科(李芳)，石家庄市第一医院泌尿外科(殷凤朝)