脊髓损伤猪模型建立的一般过程

符策岗 曾 艳 赵红卫 刘 扬 肖运祥 陈海丹

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院脊柱外科脊柱微创中心 脊柱医学与创伤研究所，湖北 宜昌 443000)



·综 述·

脊髓损伤猪模型建立的一般过程

符策岗 曾 艳1赵红卫 刘 扬 肖运祥 陈海丹

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院脊柱外科脊柱微创中心 脊柱医学与创伤研究所，湖北 宜昌 443000)

脊髓损伤；猪模型

脊髓损伤(SCI)的发病率随着现代交通和建筑事业的发展而逐年上升，给患者及患者家属带来极大的精神及经济负担。尽管对于SCI患者的临床处理已经有一定提高且可采用多种手段限制继发性损伤，但患者神经功能的恢复依旧有限，众多患者依然长期伴随神经功能不全或丧失。因此，科研工作者们尝试从多方面找寻SCI治疗的方式和方法，例如干细胞移植〔1〕、MicorRNA调节通路〔2〕、神经再生〔3〕、低温〔4〕、电刺激〔5〕、改良手术术式〔6〕或者一些其他后期护理强化疗法〔7〕等等。但无论是上述哪一项研究，一个合适的SCI动物模型是其中必不可少的关键环节。鼠因易于控制、均一性良好且经济方便等原因，成为构建SCI首选的动物模型，但近年发现，猪相对于鼠在解剖、神经生物学、心血管、胃肠道和基因组等方面与人类更为相似〔8〕。值得一提的是，猪脊柱脊膜的厚度与人类相似，可被用于脊柱压力承受方面的研究，也可用于脑脊液压力方面的研究〔9～11〕。此外，猪的病理生理变化也与人类相似，可用于研究SCI引起的局部代谢性变化〔12,13〕，同时猪体型相对较大，便于实施脊髓手术，也便于长期观察脊髓损伤后肢体功能的恢复情况而常被用于SCI手术以及影像学分析方面的研究〔14,15〕。因此，猪在构建SCI模型方面具有其独特的优势，同时猪相比于灵长类动物也更为经济，均一性也较强，本文就SCI猪模型构建的一般过程做一简要综述。

1 SCI猪模型构建的一般过程

1.1 动物的选择 大部分报道中选用体重15～20 kg雌性小型猪，病理生理状况与人类相似，部分数据如下〔8～15〕：血液值：红细胞数(6～7)×106cells/ml；血细胞比容30%～35%；血红蛋白9～11 g/dl；网织红细胞，2%～3%；白细胞数(16～17)×109/L；血小板数(300～400)×109/L；凝血酶时间25～30 s；凝血酶原时间11～12 s。血流动力学：平均收缩压(140±15)mmHg；平均舒张压(96±14)mmHg；心率(103±14)次/min；每日排尿量1.5～2 L；直肠体温(38.9±2)℃。血浆生化指标：葡萄糖(101±2)mg/dl；总蛋白(4.5±3)g/dl；白蛋白(2.6±0.1)g/dl；肌酸酐(0.6±0.01)mg/dl；钙离子(11.8±0.7)mg/dl；碱性磷酸酶(492±15)U/L。

1.2 麻醉 手术前禁食12 h，给予肌肉注射氯胺酮(35 mg/kg)、乙酰丙嗪(1.1 mg/kg)和阿托品(0.04 mg/kg)混合液镇静，麻醉实验猪后行气管插管，维持供氧和1%～3%异氟醚持续全身麻醉，麻醉完成后给实验猪头部和背部备皮。兽医工作人员全程在旁监测麻醉程度，检测内容：眼睑和角膜反射、心跳和呼吸频率、动脉血氧饱和度、直接/间接血压，呼气末二氧化碳分压、肌张力以及对伤害性刺激的反应等。

1.3 固定 实验猪以俯卧位安置于模仿脊柱外科手术台制作的平台上。将可调式吊具固定于动物的胸部和骨盆下放，保持下腹部自由悬挂，这样做能最大限度地减少腹部和胸部的压力以及术中有可能随之而来的硬膜外静脉出血。此外，平台还可起脊柱手术外固定的作用〔16〕。此外，实验猪应被安置在循环热垫上以保持体温，应行耳缘静脉穿刺以保证手术过程中药物的给予和必要的补液。最后，手术区域用酒精与氯或碘溶液消毒后铺巾，整个过程中需保证充分的手术区域暴露。

1.4 椎板切除术 选定手术位点后，做10～15 cm的手术切口，剥离脊柱两侧的肌肉组织。充分暴露椎骨后，使用咬骨钳移除棘突和椎板，充分暴露下部的脊髓。常选用的手术位点是C3～C5或L2～L4。

1.5 安置脊柱吊杆 脊柱吊杆的安置是脊髓注射(基因或细胞)治疗的必要装置。此项装置由Riley等〔17〕在2011年成功研发并使用。

安全放置好的患者，在安装固定杆的位点做1 cm的切口并在切口处盖上薄板。使用两个拉钩拉住4个经皮切口位点，牵拉并充分暴露脊髓区域(行椎板切除区域)。

1.6 硬膜开口 使用Woodson(牙科工具)在硬膜上做一个2.5 cm的切口，暴露脊髓。使用4-0的尼龙缝线将硬膜缝于脊柱两旁肌肉组织上。如有条件也可行外科手术前贴膜，以保证脊髓液不会流至手术巾内造成污染。此外，在人类的手术中，软膜表面应在外壳显微镜放大的条件下进行分离。

1.7 脊柱脊髓注射以及脊柱旁侧路注射 在给药前，静脉注射甲泼尼松龙(125 mg)以防止脊髓肿胀。

将平台上的轨制和侧轨系统调节到适合的长度，在吊杆的上方，将2个杆子和Z字形驱动器装在通用接头上。将金属管道安装到微型硬盘内，将连接管连接到微量注射器上，调整通用接头的方向并确保金属管道垂直于脊髓注射的表面。将针定位于背跟刺入区(DREZ)。DREZ通过3.5×外科手术放大镜定位，定位后将针从脊髓正中刺入<1 mm的深度。

液体可以注入软脊膜约4 mm的深度，可在进针前放置一个塑料护翼在软脊膜的表面，以防止入针过深。到达目标位置后可将金属套管拔出，露出内部的管道。注射完成后，针需要留置约1 min，以防止细胞顺着入针轨迹流出。

穿刺时尽量避开表面的血管系统，但穿刺位点的少许出血在所难免。一旦发生出血，应立即使用微型吸引器吸取干净，尽力防止血液顺穿刺位点流入脊髓内。如确定不会流入脊髓，也可以烧灼促使血液凝固。

随着针管拔出，立体定向仪应当顺着尾椎的方向迁移至下一个位点，两位点之间相隔2～4 mm并避开背部表面可见的血管，这个过程根据实验需要可以重复多次。

1.8 悬挂的注射导管 常常使用小直径的金属导管注射药物。将一个30号的可调式柔性硅橡胶管套上一个长度固定的30号金属套管斜针中，末端装有泵汉密尔顿鲁尔锁并与微量注射器连接。近端的硅橡胶管用24号钢性金属管道包裹，放于注射器边缘的尾部。翼样的结构都被安在金属管道的外部，发挥停针指示作用。每一次注射，实验用药都以适当的量通过微量注射泵注射。

1.9 缝合 一旦注射完成则移开脊柱吊架并分四层缝合切口。使用4-0号的尼龙线缝合硬脊膜，0号可吸收式线密闭缝合肌肉层。筋膜层依然使用0号可吸收式线密闭缝合，然后使用2-0号可吸收线缝合以连续缝合最外层，最后使用3-0尼龙线缝合皮肤。

1.10 术后恢复和疼痛控制 实验猪在完成手术后应监控2 h，观察麻醉后恢复情况。随后将动物送回自己的笼中，每天观察动物的摄食量，排便和排尿情况。

术后3 d，可用芬太尼贴剂(75 mg)局部贴覆手术区域，帮助缓解术后疼痛或用丁丙诺啡(0.05 mg/kg)肌注帮助缓解缓解术后疼痛。

1.11 症状和结果 在手术前记录实验猪的基本情况，术后再按实验要求观察1～7 w，收集行为数据并做神经病学分析〔18〕。采用机械性刺激脚趾或者后肢观察无收缩反应是否缺失以判定感觉系统的功能情况。使用塔洛夫评分标准，判断运动功能，评分等级如下0：麻痹，无运动；1：可观察到肌紧张，轻微移动；2：可以移动后肢但是不能坐和移动；3：能做短暂的站立和行走但是存在共济失调；4：完全恢复，具备正常步态。

操作的安全性由实验猪术后机体功能是否能恢复到术前的基线决定。短暂性神经性功能缺失在手术后1～7 d内基本恢复，这一过程与动物的品种和手术操作有关(注射的次数或其他参数)，永久性神经功能缺失不能随时间的推移而恢复。

2 前景展望

SCI模型在SCI相关研究中扮演重要的角色，准确的选择良好的动物模型对实验具有重要的指导意义。猪在病理生理、解剖、心血管、神经病学等等方面和人类有明显的相似之处。猪模型运用于SCI研究有自己的特点和优势，尤其在了解脊髓实质性注射的耐受力，对脊柱相关脱髓鞘、退行性变以及外伤性脊柱疾病实验的设计和实行具有独特的优势。此外，有些实验室在脊髓损伤方面已经做了很长期的研究，前期用的都是小鼠模型，但是近年转而使用猪模型。在老鼠身上得到研究成果，在转向人体之前，都需要在更高级的哺乳动物身上做进一步实验，啮齿类动物的神经系统相对比较简单，我们需要更高级的实验动物以获得更为准确的实验数据〔15〕。但是猪模型构建到目前为止依然不清楚能引起短暂性或永久性神经功能缺失的最大注射剂量，同时注射的位置也会影响发病率。此外，脊髓宏观的(如不经意地转动)或微观的(如心脏搏动的震动)无意识运动有可能在脊髓注射时造成风险。了解大型实验动物发病率的阈值，将有助于所有脊髓治疗方案剂量的计算。本文阐述的脊髓模型构建方式希望能在脊髓模型应用设计和实验上发挥一定作用。

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〔2016-02-19修回〕

(编辑 郭 菁)

国家自然科学基金(No.81302346)；宜昌市科技研究基金(A12301-06)；宜昌市中心人民医院基金(KFJ2011009)

陈海丹(1982-)，男，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事免疫学研究。

符策岗(1991-)，男，硕士，主要从事骨外科研究。

R744

A

1005-9202(2016)20-5182-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.121

1 三峡大学医学院