乳酸杆菌调节肠道黏膜屏障功能的研究进展①



·专题综述·

乳酸杆菌调节肠道黏膜屏障功能的研究进展①

曹力韩四海高红丽任国艳陈秀金李松彪

(河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳471023)

益生菌是指摄入足够的数量，对宿主健康能够产生有益作用的活的微生物。益生菌可通过影响肠道微生物区系发挥对宿主的健康起促进作用。许多研究表明，益生菌对人的健康作用包括：缓解乳糖不耐受症、免疫调节、降低粪便中的酶活及突变的发生、降低胆固醇及肠道疾病的发生。

乳酸杆菌作为益生菌通常用于治疗和预防肠道感染和抗生素相关腹泻。当前世界上流通使用的知名益生乳酸杆菌有：嗜酸乳杆菌NCFM (Lactobacillus acidophilus NCFM) 、干酪乳杆菌Shirota(Lactobacillus casei Shirota )、植物乳杆菌WCSF1(Lactobacillus plantarum WCSF1)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)等[1]。研究表明，一些乳酸杆菌能够降低难辨梭菌相关腹泻的复发率、预防早产儿坏死性小肠结肠炎。用包含乳酸杆菌的益生菌制剂可用于治疗坏死性小肠结肠炎，其机制主要是加速了固有免疫应答基因的成熟，这种作用具有菌株特异性[2]。此外，乳酸杆菌在治疗和预防炎性肠道疾病(Inflammatory bowel disease,IBD)[3,4]、直肠结肠癌的预防及肠易激综合征的治疗取得了良好的结果[5,6]。在肠道寄生虫感染条件下，乳酸杆菌通过IL-10介导的宿主防御途径促进了寄生虫的排出[7]。以上报道显示，乳酸杆菌在预防和治疗肠道疾病方面具有重要的作用。

肠道黏膜形成了一道防御屏障，能有效地阻止肠道内细菌及毒素等有毒有害物质进入体内，以保证机体内外环境的稳定。肠道黏膜屏障主要包括：覆盖于上皮表面的黏液层、由柱状上皮细胞构成的上皮细胞层及肠黏膜免疫系统构成的免疫防御系统。对肠黏膜屏障功能和完整性的影响可能是乳酸杆菌有益于宿主的一个主要方面，这不仅体现在乳酸杆菌对肠道黏膜发育的促进作用和对炎症过程的调节，也体现在其对黏膜细胞基因表达的调控。乳酸杆菌可通过保证肠黏膜的完整性来改善肠道屏障功能。本文就乳酸杆菌对肠道黏膜屏障功能调节的相关研究做一综述。

1乳酸杆菌对肠道黏液层的调节

覆盖于肠道表面的黏液层是肠道黏膜屏障完整性的组成部分，在阻止肠腔微生物及其产物穿过肠黏膜起到重要的作用。肠道黏液的主要成分为杯状细胞及黏膜下腺的黏液分泌细胞分泌的黏液蛋白(Mucin,MUC)[8]。MUC是一种糖蛋白，其在肠道形成的凝胶层除了在机体与外环境之间形成保护性屏障外，还具有润滑作用[9]。截至目前，所鉴定的MUC至少有11种：MUC1-4、MUC5A及MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC13和MUC20[10-12]。

Pullan等[13]报道，IBD患者黏液层厚度的降低将增强肠道微生物对免疫系统的刺激，进而延长炎症的持续时间。黏液的分泌及其向肠腔转移速度则是一种动态平衡关系，这种动态平衡关系将影响黏液层厚度。在溃疡性结肠炎条件下，一些区域黏液层的缺乏可能是黏液分泌不足或过度的移向肠腔所致。Fyderek等[14]研究认为，IBD患者炎症部位的黏液层较薄，且这与乳酸杆菌数目降低有关。最近研究报道显示，肠道MUC2基因表达与乳酸杆菌菌株有关[15]。Caballero-Franco等[16]研究发现，包含乳酸杆菌的益生菌制剂可诱导结肠上皮细胞MUC基因的表达。这些报道表明，乳酸杆菌可调节肠道黏液层的厚度及黏液蛋白相关基因的表达。

三叶肽家族(trefoil factors，TFFs)是由杯状细胞分泌的一种蛋白酶抗性因子,其分子量大小为12～22 kD。主要有3个成员：TFF1、TFF2和TFF3。TFF1和TFF2主要在胃部产生，而TFF3主要由小肠和大肠的杯状细胞分泌产生[17]。研究表明，TFFs在维持肠道上皮完整性方面具有明显的作用。在损伤黏膜的修复过程中，转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)和表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)等细胞因子可调节TFF2和TFF3的表达及控制上皮细胞的增值和迁移[18]。与EGF功能相似，TFF3通过促进有丝分裂也能够提高上皮的修复能力[19]。而乳酸杆菌可提高肠道杯状细胞的密度和改善肠道的屏障功能[20]，这种作用可能与TFFs的表达有关。

2乳酸杆菌对肠道上皮屏障功能的调节

肠道上皮屏障由单层柱状上皮细胞及细胞间的紧密连接构成。饮食成分、胃肠道分泌的产物及药物等各种物质可破坏上皮屏障，导致上皮的脱落和损伤的发生。此外，肠道上皮损伤后，将经历一个损伤愈合的过程，这一过程需要邻近损伤区域的上皮细胞向损伤区域迁移、增殖和分化。目前，已有研究关注乳酸杆菌对损伤上皮愈合及紧密连接结构恢复过程的影响和调节作用。

2.1乳酸杆菌对肠道上皮损伤愈合的调节Jones等[21]研究发现，乳酸杆菌可刺激肠道上皮细胞增殖，而增殖则对损伤上皮的愈合具有重要意义。提示乳酸杆菌可调节损伤上皮的重建过程。肠道上皮重建过程需要隐窝部新产生的细胞沿肠绒毛迁移以补充损失的细胞。这一过程也涉及肠隐窝干细胞分化成不同的细胞谱系，包括吸收细胞，杯状细胞，Paneth细胞及不同类型的内分泌细胞。未分化上皮细胞的成熟和分化对于维持黏膜上皮的完整性和功能活性是非常重要的。Swanson等[22]发现，乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus strain GG,LGG)通过诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生调节细胞的迁移，同时增强了黏着斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)磷酸化，而FAK则是激活细胞迁移的关键蛋白。提示乳酸杆菌可通过FAK途径促进损伤上皮的修复。

2.2乳酸杆菌对上皮紧密连接结构的调节肠道上皮细胞间的紧密连接结构最初是通过电子显微技术被人们所认识。透射电镜下，相邻细胞的顶膜和侧面之间显示出一系列被精确定位连接结构；冰冻刻蚀电镜表明，有三个被精确定位的连接环绕每个细胞形成了一个连续纤维丝带。紧密连接纤维丝由完整的膜蛋白复合物构成，并可结合到胞质斑蛋白上。胞质斑蛋白负责将紧密连接的胞质中组分系到细胞骨架上。紧密连接(tight junction，TJ)是一个多功能复合体，在邻近细胞顶膜之间形成一个密封。TJ密封了两个细胞之间细胞旁的空间，防止微生物和其他抗原物质于细胞旁途径扩散通过上皮。TJ是一个动态的屏障结构，由于要与食物残渣、病原体及共生菌等外部刺激相互作用，TJ将不断地发生改变。TJ结构在限制病原体入侵的同时，它还能够调节营养素、离子及水分的吸收。与TJ相关的蛋白包括ZO(Zonula occludens)蛋白、Occludin蛋白、Claudin蛋白家族和Tricellulin蛋白[23]。

许多体内外的研究已经表明，乳酸杆菌的菌株特性和剂量都会影响紧密连接蛋白的表达和分布[24-27]。Resta-Lenert and Barrett[28]研究显示，乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)提高了HT-29细胞和Caco-2细胞的通透阻力。这种对上皮通透阻力的影响伴随紧密连接蛋白磷酸化水平的维持或升高。用乳酸杆菌处理HT-29细胞和Caco-2细胞也导致P38、ERK、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和JNK途径的活化[28,29]。基因水平的研究表明，乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum MB452)改变了许多与紧密连接相关基因的表达水平，这些基因包括编码Occludin蛋白、细胞骨架锚定蛋白及微管蛋白的基因[24]。动物模型实验结果显示，乳酸杆菌降低了肠道的通透性、改善了疾病状态[30]。用包含多种乳酸杆菌的混合益生菌制剂预先灌服急性胰腺炎模型大鼠，结果显示，乳酸杆菌可抵抗由氧化应激导致的肠道通透性的增加、细菌移位、上皮细胞凋亡和紧密连接蛋白的破坏[31]，这一作用可能与乳酸杆菌诱导的黏膜谷胱甘肽及谷氨酸半胱氨酸连接酶活性增加有关。

2.3乳酸杆菌对黏合链接的调节E钙蛋白(E-cadherin,CDH1)是存在于上皮细胞间黏合链接结构中的钙黏蛋白家族成员，也是微生物黏附的主要受体。编码E钙蛋白的CDH1 基因甲基化,以及E钙蛋白的细胞外域水解,将导致上皮细胞间的黏合连接松解，有利于病原体如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的定植，进而引起病理变化[32]。研究显示，乳酸杆菌通过调节E钙蛋白基因的表达水平，起到稳定黏膜屏障的作用，提供黏膜对病原体的抵抗力[33]。

以上报道提示，乳酸杆菌对损伤肠道上皮具有一定的修复功能。这种修复作用主要通过促进肠道上皮的增值和调节上皮细胞间的紧密连接及黏合链接结构相关蛋白来维持和改善肠道黏膜的完整性。

3乳酸杆菌对肠道上皮凋亡的影响

除了对紧密连接蛋白的影响，益生菌也能够通过促进细胞的存活防止细胞因子及氧化剂诱导的上皮损伤。已有研究报道，乳酸杆菌(Lactobacillus GG)及其释放的可溶性因子(P75和P40)通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)依赖的模式激活抗凋亡基因Akt，抑制促凋亡途径(p38/MAPK)活化，从而阻止上皮细胞的凋亡[34,35]。这种凋亡水平的降低将有助于维持上皮屏障的完整性及降低黏膜屏障的破坏而增强对病原体的抵抗。另有一项体外研究表明，乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum 299v)提高了凋亡蛋白家族抑制剂成员(HIAP2/cIAP)的表达水平[36]。 Di等[37]的研究也显示，乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri SF1183)所分泌的分子能够与人的肠道细胞-HCT116相互作用，导致HCT116细胞的凋亡水平降低，从而表明，乳酸杆菌所介导上皮细胞的凋亡水平的降低，在保护上皮屏障完整性及重塑肠道黏膜组织稳态方面显示出重要的调节作用。

4乳酸杆菌对肠道黏膜免疫屏障的调节

由肠系膜淋巴结、B细胞、辅助性T细胞、浆细胞和肥大细胞构成的肠道黏膜免疫系统形成了一道免疫防御屏障，在保护机体免受病原微生物的侵害方面发挥重要的作用。 乳酸杆菌可作为宿主非特异性的免疫调节剂，通过其本身或菌体成分刺激机体免疫细胞，产生细胞因子，促进巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞活化而发挥作用。乳酸杆菌还具有促进机体B细胞产生抗体而发挥特异性免疫的作用。

Roessler等[38]研究表明，乳酸杆菌能够提高单核细胞和粒细胞的吞噬活性。乳酸杆菌也可使克罗恩病患者巨噬细胞产生大量的粒细胞集落刺激因子(CSF)，导致TNF-α水平降低[39]。表明乳酸杆菌对巨噬细胞有重要调节作用，乳酸杆菌与巨噬细胞相互作用在一定程度上是通过甘露糖受体(CD206)途径实现的。

树突状细胞(DCs)是最重要的抗原递呈细胞。乳酸杆菌对肠道黏膜DCs功能的调节及Treg细胞(调节性T细胞)的诱导作用日益受到关注。许多研究已经表明，乳酸杆菌通过诱导DCs的成熟、MHC(主要组织相容性复合体)及共刺激分子和活化因子的表达将抗原呈递给T细胞来调节DCs的功能[40]。乳酸杆菌可诱导DCs分泌IL-12、IL-10、TNF-α等细胞因子。近期的研究显示，乳酸杆菌(Lactobacillus pentosus strain b240)通过TLR(toll样受体)-2介导的途径促进了DCs分泌IL-6、IL-10及IFN(干扰素)-γ等细胞因子[41]。一些研究也关注乳酸杆菌对Treg细胞的诱导作用。报道显示，当T细胞与DCs培养时，特定的乳酸杆菌可诱导Treg细胞产生IL-10，这种Treg细胞具有轻度抑制外周CD4+T细胞的作用[42]。

现阶段的研究认为，初始T细胞(Th0)激活后分化为三类细胞群：Th1型细胞、Th2型细胞以及上面所提到的Treg细胞。Th1和Th2两类细胞的激活相互抑制。Th0向Th1和Th2的分化主要取决于初始致敏时的细胞因子环境。调节性T细胞是一类不同于Th1和Th2细胞，具有免疫调节作用的T细胞群体，这些细胞参与多种免疫性疾病发生的病理过程。

用小鼠大肠炎症模型实验表明，在乳酸杆菌与病原微生物共同应激下，乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum Lp91)与宿主免疫系统相互作用而起到保护效应，这种保护效应一定程度上是通过T细胞的免疫调节作用而实现，包括Th1和Th2的免疫应答反应[43]。Jiang等[44]用乳酸杆菌作为抗原表达载体研究发现，表达胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)和吞噬刺激素的乳酸杆菌能够刺激固有免疫细胞分化，包括向辅助性T细胞和调节性T细胞的分化，诱导Th1和Th17产生应答反应并降低了Treg细胞的应答反应。乳酸杆菌通过激活MAPK信号途径而使Th1细胞和Treg细胞做出应答反应[45]。此外研究还发现，乳酸杆菌(Lactobacillus.reuteri)通过对CD4+Foxp3+CD25+Treg细胞的调节作用，可救治饮食诱导的糖尿病和肥胖病，并有刺激Treg细胞发育的作用[46,47]。乳酸杆菌在不同生理和病理条件下所发挥的作用，通常是通过平衡Th1/Th2及诱导Treg细胞的发育和释放相关的细胞因子对肠道黏膜屏障起到保护作用。

Kotani等[41]报道，在乳酸杆菌与肠道PPs(派伊尔氏淋巴结)分离获得的DCs和B细胞共培养体系中，乳酸杆菌(Lactobacillus pentosus Strain b240)能够刺激B细胞产生大量的IgA。Sakai等[48]的研究也得出了相似的结果，即口腔灌服乳酸杆菌，增强了肠道IgA的表达量。IgA是机体产量最丰富的免疫球蛋白亚型，而分泌型IgA(sIgA)主要存在于乳汁、支气管液及胃肠液等分泌液中，通常以二聚体的形式存在。能够较长时间存在于肠道中发挥免疫功效。大约80%的IgA分泌细胞定位于肠道黏膜。缺乏IgA或影响IgA分泌将会提高机体对肠道毒素和病原体的易感性。肠道内环境的稳定需要TLR的参与，而乳酸杆菌能够诱导TLR的信号转导机制，进而发挥保护功能。TLR启动信号转导的意义在于：可以激活一系列重要的基因以及引起相应细胞的活化。

肠道黏膜的肥大细胞和NK细胞在肠道黏膜稳态及屏障功能的维持方面具有重要的作用，肥大细胞的缺失降低上皮细胞的更新及上皮细胞沿隐窝-绒毛轴的迁移[49]。乳酸杆菌对肠道黏膜屏障具有保护作用，但其对肥大细胞的影响尚未见报道。尽管有报道显示，乳酸杆菌(Lactobacillus pentosus)增强了脾脏NK细胞的活性和IFN-γ的产生，且这种作用是由于乳酸杆菌引起DCs产生IL-12，间接导致NK 细胞产生IFN-γ[50]，而乳酸杆菌在肠道黏膜对NK细胞的影响鲜有报道。

5结语

肠道黏膜所形成的屏障对人体的健康是必需的。当该屏障遭到破坏，大量的微生物抗原横跨肠道黏膜，导致微生物抗原的免疫原性发生变化及肠道上皮通透性的增大。实践证明，采用乳酸杆菌预防或治疗炎症及氧化损伤诱导的肠道屏障功能损坏是一条重要途径。然而，不同临床应用研究发现，一些条件下乳酸杆菌能够降低肠道通透性，而某些条件下，乳酸杆菌的作用并不显著；此外，乳酸杆菌对肠道通透性改善与临床症状的变化并非总是一致的。所以，需要更多的研究去做以澄清乳酸杆菌与肠道屏障功能的变化及临床症状之间的确切关系。近年来，乳酸杆菌作为免疫调节剂在国内外取得了迅速的发展，已成为一门新兴的基础学科和迅速增长的朝阳产业，一些特定乳酸杆菌菌种也应用于食品、保健、医疗及动物生产等领域。但在各领域的应用实践中，合适菌株的筛选，才能为相关产品的开发和临床试验奠定基础，才能保证其具有显著的功效。此外，乳酸杆菌作用机制也值得探讨，以促进其推广应用，这一课题的深入研究也为预防和治疗肠道疾病提供一条崭新途径。

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[收稿2015-03-20二次修回2015-12-21]

(编辑许四平)

中图分类号R392

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0419-05

作者简介：曹力(1979年-)，男，博士，讲师，主要从事益生菌与肠道黏膜免疫相关研究，E-mail:caoli2015@sina.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.028

①本文受河南科技大博士启动基金(400913480041)及国家自然基金面上项目(31471658)资助。