刍议大鼠线栓法MCAO模型尚待完善之处*

曹泽标，周小青，余望贻，陈娉婷，刘旺华

(湖南中医药大学，长沙 410208)

刍议大鼠线栓法MCAO模型尚待完善之处*

曹泽标，周小青△，余望贻，陈娉婷，刘旺华

(湖南中医药大学，长沙 410208)

结合文献及实践认识，发现大鼠线栓法大脑中动脉栓塞(MCAO)模型存在一些尚待完善之处。通过加强相关生理参数的研究，改良或引进即时、客观和可重复的模型评价手段，深化模型的病证及论治探讨，重视造模后的营养支持及护理，必将极大地促进模型的规范化，提高造模的成功率，降低大鼠死亡率，凸显中医辨证论治的特色，为缺血性中风病的实验研究奠定坚实的基础。

大脑中动脉栓塞模型;生理参数;模型评价;辨证论治;营养支持;护理

脑卒中以其高发病率、病死率和致残率，已成为当前实验研究的热点。大鼠线栓法大脑中动脉栓塞(MCAO)模型由Koizumi等［1］于1986年首创，后经Zea-Longa等［2］及大量研究者的不断改进，现已成为研究缺血性脑卒中的主要模型，也被认为是最合适的诱发血瘀证生物表征的脑缺血模型［3］871。本研究团队10余年来关于丹龙醒脑方的系列研究大多采用该模型，因而对模型有较深了解，发现既往对模型的研究多集中在造模关键技术的改进，关于模型生理参数、评价手段、病证论治、营养支持及护理等方面的探讨涉及较少，而这些同样与实验的成败密切相关，故尚待完善。笔者遂结合文献及实践认识，试作如下刍议。

1 加强对MCAO模型大鼠相关生理参数的研究

MCAO造模的关键技术有线栓的插入方式、插入深度、头端直径、栓塞时间等。当前，对这些关键技术的探讨较多，但结果不统一，一个重要原因即忽视了关键技术的确定无不以大鼠的生理参数为基础。因此，有必要加强对大鼠相关生理参数的研究，从源头上规范造模。与关键技术相应，本模型主要生理参数有大脑中动脉(MCA)起始部与颈总动脉(CCA)分叉处之间的距离、颈总或颈外动脉及大脑前动脉内径、CCA走形图及沿途较大分支所在部位等。另外，还需就这些生理参数的品系、体质量、雌雄、鼠龄等因素的差异性进行研究。

基于此少数学者进行了部分研究，如徐佳等［4］采用动脉灌注显色铸型法，测量8只体质量247～340 g的SD雄性大鼠MCA起始部距颈内动脉起始部的距离，结果发现其距离在1.55～1.65 cm之间，据此研究栓线插入深度，发现小于等于1.60 cm的造模成功率为28.57%，大于1.60 cm的造模成功率为83.33%。Aspey等［5］分别选用3种品系的大鼠(Wistar大鼠、SD大鼠、Fisher-344大鼠)采用相同的技术进行 MCAO造模，发现3组在运动功能改善、梗死程度和死亡率等方面存在差异，进而认为对不同品系的大鼠在造模技术上应有所不同。可见，生理参数及其影响因素的研究对关键技术的确定具有重要意义。然而国内外对相关生理参数的研究虽有所涉及，但报道不多，且都局限于小样本，造成结果悬殊较大，从根本上导致造模关键技术和规范化难以实施，影响造模的成功率。因此，从加强对造模相关生理参数的研究为切入点和立足点，将从根本上规范当前MCAO造模方法的不统一，有利于提高模型和实验的可重复性。

2 改良引进即时、客观和可重复模型评价手段

当前用线栓法制备MCAO模型仍属盲插，实验者全凭对上述关键技术的控制、手下的感觉及个人经验等主观即时地认为MCA已经被完全栓塞。从文献报道造模的成功率可知，仍有相当比例存在判断错误。同时，目前对造模成功与否的评价多依赖神经功能缺损评分和脑梗死体积测定。前者需大鼠清醒后才能初步评价，由于麻醉、迟发性神经元死亡、个体差异等存在，常影响超急性期的行为学判断，虽以大鼠体征为依据，仍不能避免个人的主观偏向，不过该法具有无创、能重复观察的优势。脑梗死体积的测定普遍采用TTC染色，被认为是造模成功的金标准，具有客观、精确的特点。但由于再灌注24～48 h后处死取脑观察无法重复进行，染色后标本很难再行其他检测。二者各有优劣，但都无法做到边插线边判断的即时评价，因此亟需改良或引进兼具即时、客观和可重复等特点的模型评价手段。

有研究者［6］采用激光多普勒分别测量造模前后局部脑血流量并进行评价。用牙科钻将颅骨磨薄，作为多普勒激光探头测量位点，测量并记录造模前双侧局部脑血流量基值，并于MCAO术后即刻再次进行测量，若局部脑血流量下降至同侧梗死前测定值的35%以下，即为造模成功。经解剖和TTC染色验证发现，准确率为100%，明显高于神经行为学评分法(86.21%)，具有良好的敏感性和准确性。虽然文献中未提及对局部脑血流量高于同侧梗死前测定值的35%时是否可在造模过程中通过及时更换线栓，调节插入深度和角度使造模成功，但显然是可行的。该法使盲插变为半引导插，极大地提高了造模的成功率，减少了动物的浪费和实验的时间，不失为对模型即时、客观和可重复评价手段的一种有益探索。

3 深化模型的病证及论治研究

MCAO模型作为脑缺血再灌注模型，是目前研究缺血性脑卒中的主要选择，也常作为中医缺血性中风病血瘀证模型。然而笔者认为，该模型与临床的拟合度还有一定差距，最主要的原因在于模型造成的是一侧MCA完全栓塞的大面积脑梗死，而临床常见小动脉栓塞形成的小面积脑梗死，MCA完全栓塞的病例极少，显然不能全面反映临床缺血性脑卒中的实际情况。相关实验研究也发现，大鼠大脑中动脉远端阻塞较近端阻塞的脑梗死体积较小，以皮质区损伤为主，对运动功能影响较小，存活时间较长［7］。临床研究也显示，缺血性中风急性期大小动脉病变表现出不同的证候演变规律，大动脉病变组火证、痰证、血瘀证均较小动脉病变组发生率高，大动脉病变组证候发生率多为发病后先升高后下降;而小动脉病变组多表现为先下降后升高再下降［8］。可见，MCAO模型在反映临床缺血性中风病病证的普遍性和代表性方面有待完善。

另外，在查阅文献时发现，对于该模型的论治，除对证的活血化瘀通络法外，也有用逐瘀化痰开窍法、益气活血法、化瘀补肾法甚至单纯采用补肾法、健脾法等进行治疗，相应方药也差别较大，但都报道取得了较好的疗效或能起到一定的干预作用。根据“以方测证”和“有是证用是方”的理论，有理由推测模型演变过程中还可能存在痰证、肾虚证、脾气虚证等。在实验中我们也发现，模型组多有精神萎靡、表情淡漠、活动减少、身体蜷缩、食欲减退、纳差、大便稀溏、体质量明显减轻等症状和体征，提示与以上推测基本相符。当然，具体模型主要包含哪些证，各证的发生、演变及时间窗如何将有待进一步研究。相信通过对相关问题的探讨和明晰，将极大地纠正当前把中医方药当成西药一样采取现代药理式针对西医病治疗的局面，进一步彰显中医辨证论治的特色。

4 重视造模后的营养支持及护理研究

如上所述，在实验中发现大鼠造模后常有明显的进食减少、便溏、体质量下降，不少因此而死亡，与文献报道［9］基本相符。其原因可能与大面积脑梗死后味觉、咀嚼吞咽、肢体运动功能障碍及应激性胃溃疡等有关。然而，大鼠日常的生命维持、组织修复、细胞增殖都需要充足的营养作为物质基础。如果连基本的生命都无法维持，实验指标的检测也必定深受影响，极有可能无法检出。因此，有必要对造模后大鼠进行适时适当的营养支持。这与临床发生大面积脑梗死后对患者采取肠外或肠内营养支持，并根据恢复情况逐渐给予流质、半流质及普食等处理相符。临床研究表明，对脑卒中患者的早期营养支持，在提高营养状态及减少并发症方面效果显著，应当加强对有营养风险患者的临床营养支持管理［10］。但是，目前MCAO模型大鼠仍然普遍采用与造模前一样的颗粒状硬质饲料喂养，明显不合乎临床实际，反而增加了死亡率，不利于实验的顺利进行。另外，当前对于造模苏醒后的护理，基本与造模前无异，并未在保暖、卫生清洁、预防并发症及动物福利等方面予以特殊的调护，这也是造成模型高死亡率的一个被忽视却很重要的原因，因此有必要引起重视。

虽然造模后营养支持和护理如此重要，但极少有相关专题研究报道，只在个别文献中有所流露，但并未引起关注。有鉴于此，笔者再次呼吁应重视对造模后的营养支持及护理研究。对于营养支持的研究，可以采用体质量、存活时间、死亡率等作为指标观察其有效性，同时还需注意营养支持的安全性。研究表明，脑卒中后常并发应激性高血糖，严重高血糖会显著增大脑梗死面积，加重神经功能损伤［11］。而严重高血糖的发生又常与营养支持方式、介入的时间窗、给予营养的品种、剂量、频率等密切相关。因此，必须逐一进行探讨，摸索出合理的营养支持方案。对于护理的探讨，可用并发症发生率、各时间段大鼠死亡率及重要微观参数为指标进行对比观察。通过相关研究，将为实验的顺利开展尤其是造模后较长时间的观察检测提供良好的前提。

5 结语

大鼠MCAO模型问世近30年来，为缺血性中风病的实验研究做出了突出贡献，研究者对该模型的改进也方兴未艾。相信通过加强对相关生理参数的研究，改良或引进即时、客观和可重复的评价手段，深化模型的病证及论治探讨，重视造模后的营养支持及护理研究，必将极大地促进模型的规范化，提高造模的成功率，降低大鼠死亡率，凸显中医辨证论治的特色，为缺血性中风病的实验研究奠定坚实的基础。至于这些尚待完善之处涉及的具体实验方案，还有待进一步的探讨。

［1］Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al．Experimental studies of is-chemia brain edema．A new experimental model of cerebral embolism infarcts in the ischemia area［J］．Jpn J Stroke，1986，8: 1-8．

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．stroke，1989，20(1):84-91．

［3］李乐军，田金洲，尹军祥，等．不同脑缺血诱发血瘀证表征模型的研究［J］．北京中医药大学学报，2007，30(12):816-818．

［4］徐佳，葛林宝，徐鸣曙，等．大鼠栓线法MCAO模型中栓线插入深度的研究［J］．上海实验动物科学，2002，22(4):209-212．

［5］Aspey BS，Taylor FL，Terruli M，et al．Temporary middle cerebral artery occlusion in the rat:consistent protocol for a model of stroke and reperfusion［J］．Neuropathol Appl Neurobiol，2000，26 (3):232-242．

［6］崔景军，何娇君，李晶，等．大鼠大脑中动脉梗死模型的评价标准探讨［J］．天津中医药，2013，30(1):33-35．

［7］王柳清，邵蓓，林真珍，等．大鼠大脑中动脉近端及远端阻塞脑缺血模型的脑梗死体积和行为学差异比较［J］．中国临床神经科学，2013，21(3):259-263．

［8］高芳，扎娃，刘强，等．缺血性中风急性期大小动脉病变的证候演变规律研究［J］．北京中医药，2013，32(7):490-493．

［9］张小冲，赵浩，马建华，等．线栓法大鼠MCAO模型的实验研究［J］．医学研究杂志，2013，42(6):55-58．

［10］李改梅．脑卒中营养风险患者早期营养支持治疗的临床价值探讨［J］．临床合理用药杂志，2014，7(3B):106-108．

［11］石见，谭盛，吴培华，等．不同水平高血糖对大鼠局灶脑缺血损伤的影响［J］．中国神经精神疾病杂志，2014，40(5):309-313．

Discussion on the MCAO model of rat line bolt method is still to be perfected

CAO Ze-biao，ZHOU Xiao-qing△，YU Wang-yi，CHEN Ping-ting，LIU Wang-hua
(1．Subject of Diagnostics in Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China)

combining with the literature and practice，found middle cerebral artery occlusion model(MCAO)with intraluminal thread method in rats remains to be perfect in some ways．Through the research to strengthen the related physiological parameters，modify or introduce instant，objective and repeatable model evaluation means，deepen to explore the diseases，syndrome and treatment of the model，pay attention to nutritional support，it will greatly promote the standardization of the model，improve the success rate of the model，reduce the mortality of rats，highlight the characteristics of the therapy with syndrome differentiation of TCM，and lay a solid foundation for the experimental study of ischemic stroke．

Middle cerebral artery occlusion model;Physiological parameters;Model evaluation;Syndrome differentiation;Nutritional support;Nurse

R285．5

A

1006-3250(2016)01-0044-03

2015-04-21

国家自然科学基金面上项目(81373702)-基于Wnt/βcatenin通路探讨脑缺血后神经再生及丹龙醒脑方的促进机理研究;国家自然科学基金面上项目(81473567)-基于“土主承载”的脑缺血神经细胞失巢凋亡及健脾补土法干预机理研究;国家自然科学基金青年基金项目(81202632)-从稳定细胞外基质探讨健脾补土法抗脑缺血损伤机制;教育部博士点基金(20124323120003);湖南省自然科学基金资助项目(13JJ3097);湖南省教育厅科研项目(14B134)

曹泽标(1990-)，男，湖南郴州人，在读硕士，从事中医心脑血管疾病的临床与研究。

△通讯作者:周小青，男，教授，医学博士，博士研究生导师，E-mail:zxq5381@sohu．com。