10味温中散寒药对胃实寒证大鼠交感神经-肾上腺机能的影响*

黄燕琼，秦华珍，余腾飞，刘 颖，谭喜梅，李文强，翁铭钻，张兴燊，王 勤

(1．广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530011;2．广西中医药大学，南宁 530001)

10味温中散寒药对胃实寒证大鼠交感神经-肾上腺机能的影响*

黄燕琼1，秦华珍2△，余腾飞2，刘 颖2，谭喜梅2，李文强2，翁铭钻2，张兴燊2，王 勤2

(1．广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530011;2．广西中医药大学，南宁 530001)

目的:观察干姜等10味温中散寒药对胃实寒证大鼠尿17-OHCS与CAs以及血清ACTH、D-β-H的影响，探讨其对胃实寒证大鼠交感神经-肾上腺系统机能的影响，揭示10味药的温热药性本质。方法:除空白组外，其余动物灌服知母冰水液建立胃实寒证模型。造模成功后分为模型组、阳性组、干姜等10个温中散寒药组以及石膏、黄连2个反性药对照组，给药3次后检测尿液17-OHCS及CAs含量和血清ACTH、D-β-H含量。结果:模型组大鼠尿液中17-OHCS、CAs、血清中ACTH、D-β-H含量均降低，各治疗组大鼠均显著升高。结论:10味温中散寒药有提高胃实寒证大鼠交感神经-肾上腺机能的作用，通过增强机体交感神经-肾上腺机能而呈现其温热药性。

温中散寒药;胃实寒证;17-OHCS;CAs;ACTH;D-β-H;交感神经-肾上腺机能;药性本质

中药药性理论是中药最重要的学术特征，中药的寒热温凉四性在药性理论中居首要地位。“疗寒以热药”、“疗热以寒药”，古往今来一直是指导临床用药的纲领，因此在中药药性理论研究中受到高度重视。而温中散寒药是温热药性最为突出的一类药物，此类药以温中散寒为主要功效，临床主要用于脾胃实寒证［1］。为研究温中散寒药的药性本质，揭示温热药性的科学内涵，本研究在中医药理论指导下，以脏腑辨证为核心，以寒热辨证为纲要，选择归脾胃经的干姜、高良姜、丁香、小茴香、吴茱萸、肉桂、花椒、胡椒、荜茇、荜澄茄共10味温中散寒药为研究对象，以归胃经的知母冰水煎液复制大鼠胃实寒证模型，选取辛热入脾的附子作为阳性对照药，并选取归胃经的寒性药石膏、黄连作为反性对照药，观察10味温中散寒药对胃实寒证大鼠尿液17-羟皮质类固醇(17-OHCS)、儿茶酚胺类物质(CAs)包括肾上腺素(Ad)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)的影响，以及对血清促肾上腺皮质素(ACTH)、多巴胺β羟化酶(D-β-H)的影响，探讨其对交感神经-肾上腺机能的影响，探寻温中散寒药的温热药性本质，以揭示中药药性理论的科学内涵，现就研究结果作一报道。

1 材料

1.1 动物

雄性SPF级SD大鼠，体质量(220±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(许可证号SCXK(湘)2009-0004)。

1.2 药品

知母、附子、干姜、高良姜、丁香、小茴香、吴茱萸、肉桂、花椒、胡椒、荜茇、荜澄茄、石膏、黄连等均购自南宁生源中药饮片有限责任公司(生产批号分别为 111209，110113，110914，110608，111027，110824，110928，110927，110815，111021，110927，110921，110402，111014)。经广西中医药大学中药鉴定学教研室田慧教授鉴定均为2010版药典收载品种。取知母1 kg加10倍量的水充分浸透，武火煮开后转文火保持微沸1 h过滤，药渣加8倍量水再煎40 min过滤，合并2次滤液浓缩至0.5 g/ml生药浓度，分装保存于4℃冰箱备用。其余各种药物按照上法煎煮浓缩至所需浓度备用。

1.3 试剂

硫酸铵(高纯，批号20101025)，天津市精细化工研究所;甲醇(色谱纯，批号113904)，美国天地公司;正丁醇(色谱纯，批号1112386)，美国费氏公司;浓盐酸(批号20120621)，廉江市爱廉化工试剂有限公司;醋酸钠(批号20110105)，天津博迪化工股份有限公司;浓硫酸(批号20120503)，廉江市爱廉化工试剂有限公司;氢氧化钠(批号F20110110)，国药集团化学试剂有限公司;氧化铝(批号20090906)，成都市科隆化工试剂厂;氯仿(批号1208272)，西陇化工股份有限公司;无水乙醇(批号20120409)，成都市科隆化工试剂厂。ACTH酶免试剂盒，加拿大ELIXIR医药公司(批号051SC-Jul2013);DβH酶免试剂盒，上海越研生物科技有限公司(批号201212)。

1.4 主要仪器

BP211D万分之一克电子天平，德国赛多利斯生产;HVE-50自动高压灭菌器，日本Hirayama公司;SAITEXIANGYI．PGL-16冷冻离心机，湖南赛特湘仪离心机公司;PHS-3C型酸度计，上海盛磁仪器有限公司;RF5301PC型荧光分光光度计，日本岛津;e2695高效液相色谱仪系统，美国 Waters; SAITEXIANGYI．PGL-16冷冻离心机，湖南赛特湘仪离心机公司;EPOCH BIOTEK全波长酶标仪，美国伯腾仪器有限公司;TS-2000A其林贝尔脱色摇床，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

2 方法

2.1 动物造模与分组

实验分2批进行，每批取大鼠150只，随机取10只作为空白对照组，参照文献［2-3］并结合前期工作基础［4］，其余动物给予灌服浓度为19.44 g/kg的4℃冰知母水煎液复制胃实寒证模型，给药体积20 ml/kg，给药次数每日2次，共给药2 d。造模完成后按随机数字表法分成模型组、阳性对照组、干姜组、高良姜组、丁香组、小茴香组、吴茱萸组、肉桂组、花椒组、胡椒组、荜茇组、荜澄茄组各治疗药组以及石膏组、黄连组反性对照组。

2.2 给药与取材方法

空白组、模型组灌服常温自来水，阳性组灌服附子水煎液，其余各组灌服相应的药物提取液，给药体积10 ml/kg，各组给药剂量为成人临床用量上限的10倍。根据临床实寒证属新病、急病，治疗及时易于康复的特点，每隔12 h给药1次，连续给药3次。末次给药前各组大鼠禁食不禁水12 h，给药后立即放入代谢笼内，收集24 h尿液，取出尿液2000 r/ min下离心10 min，吸取上清液3mL用于17-OHCS的测定，另取10mL用于CAs类物质的测定。

2.3 尿液中17-OHCS含量的荧光测定［5-6］

取上清尿液3 ml，加56硫酸调节尿液pH到1，加硫酸铵3 g摇匀再加氯仿∶正丁醇=10∶1(v/v)的混合液33 ml，抽提5 min，混合液倒入2个20 lL尖底离心管内，1500 r/min离心弃去上层水液，各管吸出10 ml抽提液于15 ml具塞试管内，一管做尿空白，另一管用于尿显色测定，另作56硫酸空白管、标准显色管。各管加塞抽提5 min，1500 r/min离心15 min，吸出各管硫酸层于15 ml试管内，60℃水浴保温42 min，用流动水冷却到室温，用分光光度计在波长为410 nm下检测。

冬凌草为一种多年生的草本植物，含有难分解利用的纤维素与半纤维素。因此，筛选适宜发酵的菌种，对培养基和发酵条件进行优化，可以最大限度地利用以中药材为主要组分的培养基，释放和产生更多的活性物质。黑曲霉是一种饲用真核微生物，能产生分解纤维素、半纤维素、蛋白质和脂类等物质的酶类，对纤维素具有较强的分解利用能力，是发酵中药的主要功能菌。本实验中以冬凌草为原料，同时添加适量的麸皮作为辅料，接种黑曲霉进行固态发酵时，由于麸皮含有丰富的蛋白质、矿物质、维生素等营养物质，黑曲霉生长良好，纤维素酶的活性也较高。

2.4 尿液中CAs含量的高效液相测定［7-8］

混匀尿液后取10 ml储存备用，氧化铝吸附法处理，再进行稀释得到6个浓度的标准品，分别取不同浓度的对照溶液用C18柱4.6 mm×250 mm，直径5 μm，Ex280 nm，Em310 nm，流速0.8 mL·min－1，流动相甲醇－0.02 moL·L－1磷酸二氢钾(2∶98=v∶v)，2 ml 0.2 moL·L－1醋酸洗脱，pH3.0，0.45 μm滤膜过滤，超声脱气15 min，100 μL进样，测定其峰面积。

2.5 血清中ACTH、D-β-H含量的测定

末次给药后2 h腹腔注射10%水合氯醛3 ml/ kg麻醉大鼠，腹主动脉采血加入离心管中。室温放置待凝固后，用离心机4℃、3000 r/min离心10 min，取上清部分，按照试剂盒说明书的操作步骤测定血清ACTH、D-β-H含量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，符合正态性和方差齐性的资料采用单因素方差分析，不符合正态性和方差齐性的资料采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对胃实寒证大鼠尿液17-OHCS、CAs含量的影响

表1显示，与空白组比较，模型组大鼠尿液17-OHCS、CAs含量均显著降低(P＜0.05或 P＜0.01)。与模型组比较，除小茴香组尿液17-OHCS含量虽升高但差异不明显外，其余各温中散寒药组尿液17-OHCS、NE、Ad、DA含量均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)。反性药石膏组、黄连组与空白组比较，17-OHCS、CAs含量均显著降低(P＜0.01或P＜0.05);与模型组比较，17-OHCS、DA含量显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，Ad、NE含量比较差异无统计学意义。10味温中散寒药组与2味反性对照药组比较，在对尿液17-OHCS含量的影响方面，高良姜、荜茇、荜澄茄组有显著或非常显著的影响(P＜0.01或P＜0.05)，干姜与石膏组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与黄连组比较虽无统计学意义，但数值升高;其余6味药17-OHCS含量统计虽差异无统计学意义，但均高于2味反性对照药组。在对尿液CAs含量影响方面，10味温中散寒药尿液NE、Ad、DA含量均明显增加，与2味反性对照药组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 10味温中散寒药对胃实寒证大鼠尿液17-OHCS、CAs含量的影响(±s)

表1 10味温中散寒药对胃实寒证大鼠尿液17-OHCS、CAs含量的影响(±s)

注:与空白组比较:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与反性组石膏比较:ssP＜0.01;与反性组黄连比较:qP＜0.05，qqP＜0.01(表2同)

组 别 鼠数 剂量(g·kg－1) 17-OHCS含量(μg·24 h－1) CAs 含量NE含量(ng·24 h－1) Ad含量(ng·24 h－1) DA含量(ng·24 h－1)空 白 组 10 — 11.16±2.18 185.97±10.64 81.82± 7.82 326.63±7.42模 型 组 10 — 7.76±1.28Δ 79.95± 4.00ΔΔ 48.04± 1.47ΔΔ 35.34± 1.17ΔΔ附 子 组 10 13.50 14.47±1.93＊＊sq 261.73± 3.85s＊＊sqq 179.02± 5.35＊＊ssqq 554.74± 2.91＊＊ssqq干 姜 组 10 8.10 14.32±2.96*s 332.36± 1.67＊＊ssqq 196.68± 1.05＊＊ssqq 360.26± 3.45＊＊ssqq高良 姜 组 10 5.40 17.69±3.07＊＊ssq 133.34± 6.19＊＊ssqq 88.10± 5.33＊＊q 164.92±16.39＊＊qq丁 香 组 10 2.70 10.99±3.43* 279.00± 2.23＊＊ssqq 156.99± 2.89＊＊ssqq 261.42±14.46＊＊ssqq小茴 香 组 10 5.40 8.19±1.24 465.53±11.34＊＊ssqq 277.47±21.30＊＊ssqq 945.15±12.78＊＊ssqq吴 茱 萸 组 10 4.05 17.85±7.61* 270.22±14.99＊＊ssqq 121.78± 4.52＊＊ssqq 234.72± 1.14＊＊ssqq肉 桂 组 10 4.05 12.44±3.25* 173.05± 7.03＊＊ssqq 99.24± 1.94＊＊ssqq 243.40± 4.63＊＊ssqq花 椒 组 10 5.40 13.19±2.89＊＊ 243.87± 2.64＊＊qq 113.68± 3.83＊＊ssqq 205.44± 5.44＊＊ssqq胡 椒 组 10 8.10 15.87±7.39* 151.33± 3.44＊＊ssqq 104.31± 1.34＊＊ssqq 159.93± 3.47＊＊qq荜 茇 组 10 2.70 20.21±3.30＊＊ssqq 353.18± 5.35＊＊ssqq 292.43±27.23＊＊ssqq 881.63±11.96ssqq荜 澄 茄 组 10 2.70 21.58±2.47＊＊ssqq 219.30± 2.25＊＊ssqq 113.46± 1.76＊＊ssqq 176.84± 1.63＊＊ssqq石 膏 组 10 54.00 8.21±1.39Δ* 167.66± 4.82Δ 53.17± 1.42ΔΔ 162.06± 2.20ΔΔ＊＊黄 连 组 10 4.50 9.30±1.65Δ* 121.77± 1.28ΔΔ 49.42± 1.27ΔΔ 111.82± 0.17ΔΔ＊＊

3.2 对大鼠血清ACTH、D-β-H含量的影响

表2 10味温中散寒药对胃实寒证大鼠血清ACTH、D-β-H含量的影响(±s)

表2 10味温中散寒药对胃实寒证大鼠血清ACTH、D-β-H含量的影响(±s)

组 别 例数剂量(g/kg) ACTH含量(pg/mL) D-β-H含量(ng/mL)空 白 组 10 —148.36±17.53 328.74±38.56模 型 组 10 — 114.32± 5.68ΔΔ 278.56±61.59Δ附 子 组 10 13.50 152.13±10.08＊＊ssqq 1138.52±144.68＊＊ssqq干 姜 组 10 8.10 149.58± 8.32＊＊ssqq 613.37± 81.38＊＊ssqq高良姜组 10 5.40 149.87±25.53*ssqq 633.35± 88.46＊＊ssqq丁 香 组 10 2.70 162.25±26.04＊＊ssqq 572.83± 69.48＊＊ssqq小茴香组 10 5.40 141.06±13.37＊＊ssqq 637.18±136.01＊＊ssqq吴茱萸组 10 4.05 132.87±22.45*ssqq 612.80±111.93＊＊ssqq肉 桂 组 10 4.05 127.86±16.51*ssqq 518.08± 32.17＊＊ssqq花 椒 组 10 5.40 149.81±22.53＊＊ssqq 522.59± 35.08＊＊ssqq胡 椒 组 10 8.10 141.56±24.93*ssqq 566.98± 49.41＊＊ssqq荜 茇 组 10 2.70 156.82± 8.53＊＊ssqq 564.28± 17.84＊＊ssqq荜澄茄组 10 2.70 146.94±29.42*ssqq 573.44± 24.94＊＊ssqq石 膏 组 10 54.00 88.33±12.55ΔΔ＊＊ 301.28± 60.90Δ黄 连 组 10 4.50 92.38±17.97ΔΔ* 311.84±53.69Δ

表2显示，与空白组比较，模型组大鼠血清ACTH、D-β-H含量显著降低(P＜0.01或 P＜0.05)。与模型组比较，各温中散寒药组大鼠血清ACTH、D-β-H含量均显著升高(P＜0.01或 P＜ 0.05)。反性药石膏组、黄连组与空白组及模型组比较，大鼠血清ACTH含量显著降低(P＜0.01或P＜0.05);D-β-H含量与空白组比较均显著降低(P＜0.05)，与模型组比较差异无统计学意义。另外，10味温中散寒药组与2味反性对照药组比较，血清ACTH、D-β-H含量均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。

4 讨论

17-OHCS主要是肾上腺皮质分泌的皮质醇、皮质素及其代谢产物，主要由肾脏排出，测定给药后尿内17-OHCS的排出量，可以反映肾上腺皮质激素的释放机能［9］。当肾上腺皮质功能亢进时，17-OHCS的排出量增加。CAs包括Ad、NE及DA 3种物质。肾上腺髓质嗜铬细胞分泌Ad和NE;DA主要由交感神经节及中枢神经细胞产生，是NE生物合成的前体，可促进NE的释放。24 h尿中CAs排出量代表CAs类物质全天的代谢量，能较准确地反映肾上腺髓质功能。当肾上腺髓质功能亢进时，CAs排出量增高。ACTH是由脑垂体前叶分泌的激素，具有刺激肾上腺皮质发育和机能的作用。DβH存在于肾上腺髓质嗜铬颗粒和交感神经末梢的贮存囊泡内。交感神经兴奋时，DβH与NE通过细胞外溢方式，成比例地从交感神经末梢释放。在CAs生物合成中，DβH促使多巴胺β位上羟化而形成NE，它在交感神经-肾上腺素系统的传递中起重要作用。本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠尿液17-OHCS、CAs排泄量及血清ACTH、DβH含量均明显减少，证明胃实寒证时交感神经-肾上腺机能下降。分别给予10味温中散寒药治疗后，尿液17-OHCS、CAs排泄量及血清ACTH、DβH含量均有不同程度升高，说明温中散寒药有提高胃实寒证大鼠交感神经-肾上腺系统机能活动的作用。其影响途径可能是通过促进ACTH分泌，使肾上腺皮质激素分泌增加，17-OHCS水平升高;兴奋交感神经，使肾上腺髓质功能增强，DβH的释放增加，CAs的水平升高。

梁月华等［10］报道，交感神经-肾上腺系统机能活动的减弱和增强分别是寒证和热证形成的重要因素。温热药有提高交感神经-肾上腺(皮质、髓质)系统机能活动的作用，寒凉药与之相反。本研究选择10味温热药性突出的温中散寒药，采用施加寒凉因素的办法复制胃实寒证模型，对其交感神经-肾上腺机能的影响进行研究。本实验结果与梁月华等观点相符合，说明10味温中散寒药可以通过增强机体交感神经-肾上腺机能而呈现温热药性;同时也说明温中散寒药的温热药性与其温中散寒功效存在一致性，本研究为揭示温热药性的本质与科学内涵提供了实验依据。

此外，本研究采用石膏、黄连2味归胃经的寒凉药作为反性对照药给予胃实寒证大鼠灌胃治疗，结果与空白组比较，各项指标比较差异有统计学意义，再次说明寒凉因素可导致胃实寒证;与模型组比较，尿液17-OHCS含量及血清ACTH含量比较差异有统计学意义，说明反性对照药在一定程度上对胃实寒证大鼠有叠加效应，有加重胃实寒证的作用。这些结果从反面证明了中医“寒者热之”、“疗寒以热药”理论的正确性。10味温中散寒药与之比较，尿液17-OHCS、CAs含量及血清ACTH、D-β-H含量均升高，除6味温中散寒药对17-OHCS含量比较差异无统计学意义之外，其余均有统计学意义，再次证明温热药有增强机体交感神经-肾上腺机能作用。

［1］高学敏．中药学［M］．北京:中国中医药出版社，2002:273-286．

［2］聂子文，郭建生，陈君，等．乌药提取物对胃实寒模型大鼠cAMP，cGMP，GAS，MTL水平的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(20):162-165．

［3］刘红艳，郭建生，张猛，等．檀香对胃实寒模型大鼠的胃排空率、cAMP及cGMP的影响［J］．中药药理与临床，2011，27 (5):74-75．

［4］柳俊辉，秦华珍，刘磊，等．3味山姜属中药不同提取物对胃实寒证大鼠胃黏膜的保护作用［J］．中国实验方剂学杂志，2013，19(5):225-229．

［5］李影林．中华医学检验全书(上卷)［M］．北京:人民卫生出版社，2010:936．

［6］钱毓珍．尿17-羟Porter-Silber法测定中的一些影响因素［J］．临床检验杂志，1986，4(4):208．

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Effects of the Ten Herbs of Warming Middle-jiao and Dispelling Cold on the Sympathetic-adrenal System Function of Rats with Stomach Excess Cold Syndrome

HUANG Yan-qiong1，QIN Hua-zhen2△，YU Teng-fei2，LIU Ying2，TAN Xi-mei2，LI Wen-qiang2，WONG Ming-zuan2，ZHANG Xing-yan2，WANG Qin2
(1．Ruikang Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，China; 2．Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China)

Objective:To observe the effects of ten herbs of warming middle-jiao and dispelling cold on the output of 17-OHCS and CAs in the urine of rats with stomach excess cold syndrome，and the content of ACTH and DβH in their serum．With these works we are trying to investigate the action of the ten herbs to the sympathetic-adrenal system function of the rats and reveal the nature of the ten herbs of warm and hot．Methods:A total of 10 rats chosen from 150 SPF male SD rats were randomly selected in blank group．Dose the rest rats the decoction of Zhimu with 4℃ water to establish stomach excess cold pattern．Then divide the rats into model group，positive group，10 treatment drug groups，and 2 Antinature drug groups．Determine the content of 17-OHCS and CAs output(including Ad，NE，DA)in rat’s urine，and the level of ACTH and D-β-H in serum．Results:The contents of 17-OHCS，CAs，ACTH and D-β-H of the model groups were reduced，however，all of the index in treatment groups are significantly increased．Conclusion:The ten herbs of warming middle-jiao and dispelling cold can improve the sympathetic-adrenal system function．The method of them to cure the stomach excess cold syndrome is by enhancing the body sympathetic-adrenal cortex．

Warming middle-jiao and dispelling cold drugs;Stomach excess cold syndrome;17-OHCS;CAs; ACTH;D-β-H;Sympathetic-adrenal system function; Drugsnature

R289．1

B

1006-3250(2016)01-0119-03

2015-05-02

国家自然科学基金资助项目(81060348)-基于胃实寒证的温中散寒药性效本质研究

黄燕琼，主管药师，医学硕士，从事中药理论与中药应用开发研究。

△通讯作者:秦华珍，教授，医学博士，硕士研究生导师，从事中药理论与中药药效研究，Tel:13807816597，E-mail: qinhuazhen@126．com。