加味天雄散对少弱精子症模型大鼠附睾氧化损伤的保护作用*

耿 强，欧阳斌，郭 军，王 福，韩 强，赵 玉，李 重，余国今，高庆和，张继伟，曾 银

(1．天津中医药大学第一附属医院男科，天津 300000;2．中国中医科学院西苑医院男科，北京 100091; 3．首都医科大学附属北京中医医院男科，北京 100010)

加味天雄散对少弱精子症模型大鼠附睾氧化损伤的保护作用*

耿 强1，欧阳斌1，郭 军2△，王 福2，韩 强3，赵 玉1，李 重1，余国今2，高庆和1，张继伟2，曾 银2

(1．天津中医药大学第一附属医院男科，天津 300000;2．中国中医科学院西苑医院男科，北京 100091; 3．首都医科大学附属北京中医医院男科，北京 100010)

目的:观察加味天雄散对少弱精子症模型大鼠附睾内细胞氧化应激损伤的影响并研究其作用机制。方法:将腺嘌呤按80mg/ml浓度配制，并对Wistar大鼠进行灌胃，每日1次，连续灌胃2周，造模成功后按随机数字表法将大鼠分为模型组、中药组、正常对照组，中药组连续给药加味天雄散汤剂4周，实验结束后检测各组大鼠附睾精子密度和活率，取经固定的睾丸组织石蜡包埋切片，检测附睾组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。结果:与模型组比较，加味天雄散能显著改善大鼠睾丸组织病理状态，显著提高生精障碍大鼠模型的精子密度和精子活率，同时提高生精障碍大鼠附睾内SOD活性，降低附睾组织中MDA水平。结论:加味天雄散能够提高附睾组织中的抗氧化水平，对腺嘌呤导致的大鼠生精功能障碍具有保护作用。

加味天雄散;少弱精子症;附睾氧化;大鼠;男性生育能力

男性不育症是影响男女双方和家庭的全球性问题。我国相关流行病学资料显示，近10年来我国男性精液质量呈下降趋势［1］，少弱精子症已成为影响男性生育能力的最常见原因［2］，其中约19%的男性不育与精子活动力低下相关。少弱精子症的病理机制目前尚不十分清楚，因此临床大多治疗方法仍属于经验型治疗［3］。活性氧(ROS)为近年来少弱精子症研究的热点，相关研究证实，ROS产生过多是造成男性不育症的重要病因之一［4］。我们在先前研究中发现，加味天雄散具有良好的临床疗效。前期的实验研究也证明，其具有较强的清除氧自由基作用。基于以上研究我们拟通过观察加味天雄散对少弱精子模型大鼠附睾SOD、MDA含量的影响，探讨其提高精子活力的可能作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物

清洁级Wistar雄性大鼠，体质量250～300 g，常规饲养，整个实验过程中动物自由摄食饮水，室温控制在20～25℃、相对湿度40%～60%的环境下饲养。

1．2 主要设备

SOD采用黄嘌呤氧化酶法检测，MDA采用硫代巴比妥酸比色法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他设备有中兴202型电热恒温干燥箱(北京中兴仪器有限公司)、KUBOTA3740型高速离心机(日本生产)、DK-600A型电热恒温水箱(深圳铭科化工有限公司)，精液常规分析检查采用精液全自动分析系统(北京中科恒业科技有限公司生产)进行精液参数分析。

1．3 动物分组及造模

清洁级Wistar雄性大鼠75只，按随机数字表法分为正常组、模型组、中药全方组、中药补肾组、中药健脾组5组各15只。组内动物分别标记编号，适应性饲养1周后开始实验。根据贾金铭等实验标准，采用腺嘌呤最佳浓度100 mg/ml、1 ml/(100 g·d)剂量灌胃，空白组灌胃等量生理盐水，造模结束停止灌胃腺嘌呤。

1．4 给药方法

第11天起，中药全方组、中药补肾组、中药健脾组给予中药灌服。加味天雄散组成:附子6 g，白术15 g，桂枝10 g，龙骨10 g，茯苓15 g，黄芪10 g，菟丝子15 g，制首乌15 g，枸杞子20 g，刺五加10 g，肉苁蓉10 g，丹参10 g。补肾组全方中去掉白术、茯苓、黄芪;健脾组全方中去掉菟丝子、制首乌、枸杞子、肉苁蓉，采用单味中药配方颗粒(免煎中药由江苏省江阴市天江药业有限公司生产)加热水(水温为80～100℃)约300 ml充分搅拌。根据人与动物体表面积换算浓缩为1 ml药液/100 g体质量的浓缩液后，给予全方组动物灌胃，每日2次，空白组和模型组给予等量生理盐水，连续灌胃30 d。

1．5 取材

上述2批动物分别于第11天及第30天实验结束后断头处死，取血(大约5 ml)制备血清，迅速解剖摘取睾丸、附睾、前列腺，观察外观形态并称重。

1．6 检测指标

单侧睾丸分组放入10%福尔马林溶液固定，常规包埋、切片、HE染色进行形态学观察;附睾精子密度及活力:将大鼠的附睾头部和尾部各沿纵向垂直剪2次后，用孵育缓冲液2 ml孵育10 min，滴入精子计数池，采用计算机辅助精子质量分析检测精子密度、精子活率和附睾MDA、SOD水平。

1．7 统计学方法

采用SPSS 13．0统计软件进行统计分析，定量资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验，等级资料采用秩和检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 加味天雄散对模型大鼠睾丸组织的病理学影响

正常组大鼠睾丸生精上皮、各级生精细胞排列规则，血管丰富，间质细胞发育良好，生精小管腔均可见大量精子(图1);模型组大鼠睾丸生精上皮明显减少，生精细胞排列紊乱，部分层面缺失，生精细胞数量明显减少，生精小管腔内空虚，成熟的精子明显减少，间质细胞减少或消失(图2);全方治疗组镜下表现与正常组基本相同，生精小管管壁较厚，生精细胞规则，基底面可见各个发育阶段的细胞，细胞增殖旺盛，腔内可见成熟精子且间质稀少，血管丰富(图3)。

图1 正常组大鼠睾丸病理

2．2 加味天雄散及其拆方对模型大鼠附睾SOD和MDA含量的影响

表1显示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠附睾SOD活力明显降低;与模型组比较，补肾组和全方组大鼠附睾SOD活力明显提高;与补肾组大鼠比较，全方组大鼠附睾SOD活力提高更为明显。与正常组大鼠比较，模型组大鼠附睾MDA含量明显升高;与模型组比较，补肾组和全方组大鼠附睾MDA含量明显降低;与补肾组大鼠比较，全方组大鼠附睾MDA含量降低更为明显。

图2 模型组大鼠睾丸病理

图3 全方治疗组大鼠睾丸病理

表1 加味天雄散及其拆方对模型大鼠附睾MDA、SOD含量影响

2．3 对大鼠附睾精子浓度及活力的影响

表2显示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠精子数量减少、活力明显降低;与模型组比较，补肾组和全方组大鼠精子数量和精子活力明显提高;与补肾组大鼠比较，全方组大鼠附睾精子数量和精子活力提高更为明显。

表2 加味天雄散及其拆方对模型大鼠附睾精子质量影响(±s)

表2 加味天雄散及其拆方对模型大鼠附睾精子质量影响(±s)

注:与正常组比较:*P＜0．05;与模型组比较:#P＜0．05，##P＜0．01;与补肾组、健脾组比较:△P＜0．05

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3 讨论

少弱精子症的可知病因众多，包括生殖道感染、精液液化异常、精索静脉曲张、免疫因素、内分泌因素、遗传性因素、吸烟、饮酒及药物因素等，但这些因素如何引起精子活力的确切机制不明，而且还有约30%～40%的患者尚未发现明确的病因［5］，可见弱精子症的病理机制目前尚不十分清楚，因此现代医学在临床治疗中缺乏针对性，许多治疗方法均为经验性且疗效未达预期。活性氧(ROS)是机体组织正常有氧代谢的产物，主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。在生理情况下，ROS的产生和清除保持动态平衡，如果ROS的产生速度(氧化速度)超过了机体对其清除的能力(抗氧化能力)，可使机体内ROS堆积，致使机体处于一种应激状态，即氧化应激状态，从而造成机体损伤;线粒体是ROS作用的重要靶相细胞器，由于精子细胞富含线粒体，因此精子活性氧的产生在其线粒体内相当活跃，同时精浆中存在着大量抗氧化酶以便保持活性氧的产生和清除的动态平衡，精浆中的SOD是活性氧的重要清除物质，两者处于动态平衡。若平衡被破坏则将使精浆中的活性氧增多，精子功能受到影响［6］。人体内存在酶或非酶的自由基清除系统，SOD等是抗氧化酶系统的重要组成部分，在清除自由基和脂质过氧化物方面发挥着重要作用［7］。MDA是细胞发生脂质过氧化反应产物中具有代表性的产物，是细胞膜损伤的标志物，可间接反映机体细胞受氧自由基攻击的严重程度和体内的氧自由基代谢状况。

中医学对男性不育症的认识已有数千年的历史，属于“无子”“男子艰嗣”等范畴。《黄帝内经》记载“肾藏精”理论，提出了以肾为轴心、以先天之精为中心的生殖学说，因此肾所藏之精的亏虚是造成不育症的根本原因，也是采用补肾益精为主治疗男性不育症的依据［8］。大样本流行病学调查显示，2054例男性不育症中医辨证分型属肾虚者1261例，占总病例61．4%，也反映出肾虚是男性不育症的主要病机［9］。男子不育症的病位虽在肾，但也与脾、肝、心等其他脏腑有关，尤重在肾与脾。因脾为后天之本，气血生化之源，所以若要肾精足先要脾胃健，只有脾胃健运、脏腑之精充盛、肾精充盈，才能“精气溢泻”而繁衍后代［10］。

在男性不育症的治疗中，采用脾肾同治的原则是中医脾肾相关理论良好的体现。天雄散出自《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治第六》且有方无论。我们在天雄散的基础上加入茯苓、黄芪健脾助运，益后天化生之源以供养先天;加入菟丝子、制首乌、肉苁蓉、枸杞子等以补肾填精［11］。现代药理学研究也支持我们的观点。彭宇静等发现，菟丝子水煎液可明显提高人精子体外活动功能［12］，肉苁蓉能促进睾丸生精功能，改善附睾微环境，提高附睾组织抗氧化能力［13］;枸杞子能滋补肝肾，其成分枸杞多糖可以显著提高缺氧小鼠血浆中总SOD活性［14］;黄芪中的黄芪总黄酮具有很好的抗氧化作用［15］。我们在临床实践中也取得了较好的疗效，因此在前期临床研究基础上进行了相关动物研究。本研究发现，腺嘌呤灌胃后大鼠睾丸生精上皮明显减少，生精细胞排列紊乱，数量显著下降，生精小管管腔内空虚，附睾SOD活力明显降低，附睾MDA含量明显升高，表明少弱精子症模型成功。在相关中药复方的干预下，我们发现加味天雄散能有效改善大鼠生精功能，提高生精障碍大鼠模型的精子密度活率，同时增强生精障碍大鼠附睾内SOD的活性，降低附睾组织中MDA水平，可见加味天雄散能够通过提高附睾组织中的抗氧化水平，对腺嘌呤导致的大鼠生精功能障碍起到修复作用。

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R285．5

B

1006-3250(2015) 11-0122-03

2015-02-13

国家自然科学基金青年基金项目(81202695);中国中医科学院优势病种(CACMS08Y0025);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(ZZ070855)

耿 强，河北承德人，主治医师，从事中西医结合男科疾病的临床与研究。

△通讯作者:郭 军，主任医师，博士研究生导师，Tel:010-62835134，E-mail:guojun1126@126．com。