在骨组织愈合中炎症反应联合血管生成的研究进展①

袁 翰 蒋逸秋 郭 杨 马 勇 黄桂成

(南京中医药大学骨伤研究所,南京210023)

在骨组织愈合中炎症反应联合血管生成的研究进展①

袁 翰 蒋逸秋 郭 杨 马 勇 黄桂成

(南京中医药大学骨伤研究所,南京210023)

延迟愈合与骨不连仍然是骨科临床工作中较为棘手的问题。延迟愈合发生后，甚至需要重新显露手术，进而延长了患者在院时间，推迟了复健周期，增加治疗经费负担[1]。骨组织在愈合过程中不产生疤痕组织，这可能与骨组织独特的愈合过程有关[2]。对骨组织愈合过程中炎症反应、血管生成与组织重建之间关系的交叉研究将有助于揭示骨组织修复过程的调控机理。

骨损伤的愈合过程存在一系列精确调控的交替过程。骨组织的愈合过程从炎症反应开始，免疫细胞初期释放出炎症因子，从而招募、富集间充质干细胞并引导其分化[3]。这一关键过程也与血管再生和细胞外基质的分泌和塑形相关[4]。尤其在骨折愈合过程中，肉芽组织的产生与成熟形成了软性骨痂，提供骨组织重建过程中一定的力学稳定性。进而成纤维组织形成纤维软骨组织并进一步演变为透明软骨。细胞外基质初期包含Ⅱ型胶原，但随即在矿化前期为X型胶原替代。骨愈合过程中的软骨组织缺乏血管网覆盖，但在矿化过程中逐渐血管化。伴随着Ⅰ型胶原的沉积和交织型骨组织的出现，硬骨痂形成。进而一系列的改建过程将持续数月到数年，这其中滋养血管网的改建也伴随始终，直至达到骨组织的力学稳定状态[5]。

总之，现阶段对于骨愈合过程中炎症血管生成的研究主要集中于骨创伤后血管紊乱状态的纠正过程以及骨矿化过程中软骨内血管网的形成过程。本文综述了骨愈合过程中的炎症反应模式，以及炎症反应在骨愈合血管生成的作用机制。

1 骨修复过程中的炎症反应

免疫细胞与炎性细胞因子在骨修复过程中扮演着重要角色。由于对骨细胞与免疫细胞之间的复杂调控机制认识越来越深入，骨免疫学应运而生。

1.1 破骨细胞介导的炎症反应 在细胞来源上，破骨细胞和巨噬细胞来源于相同的祖细胞[6]。T淋巴细胞表达核因子受体活化因子配体(RANKL)刺激了破骨细胞的生成[7]。辅助性T细胞17(Th17)可以通过白介素17(IL-17)促进破骨细胞的成熟[8,9]。

随着研究的深入，更多的炎症信号分子被证实参与破骨细胞的调控。T细胞可以通过细胞间信号交互或者表达分泌转化生长因子β(TGF-β)[10]、IL-4[11]以及IL-10[12]，对破骨细胞的功能进行调节。有多条信号通路参与了炎症反应对破骨细胞的调控。Th17细胞可通过细胞因子的共同作用，激活RANKL信号通路从而启动破骨细胞的激活，并因此阻止破骨细胞分化[13]。类似的生物效应通路主要有Th1细胞分泌的干扰素γ(IFN-γ)[13],可以启动破骨细胞内特定酶的表达。该细胞间信号存在反馈机制，在破骨细胞酶功能变化时，可反向调节T细胞的增殖功能。

1.2 间充质干细胞与炎症反应的调控 在骨组织损伤发生时，间充质干细胞(MSCs)被细胞因子从外周富集到损伤部位，分化为成骨祖细胞，进一步分化为成骨细胞[14,15]。MSC细胞具有一定的免疫调节功能，可下调局部的肿瘤坏死因子α(TNF-α)并上调抗炎因子IL-10[16,17]，从而影响了局部炎症微环境。MSC细胞作为一种新的临床细胞疗法，有学者报道MSC可通过促使巨噬细胞向M2型转化进而调节巨噬细胞的功能[18]。同时通过转化生长因子β(TGF-β )和骨形态发生蛋白(BMP)信号通路，MSC细胞可以抑制细胞毒性T细胞的产生，并促使调节型T细胞的产生[19]。因此除了细胞因子可以刺激MSC干细胞的增殖与分化，干细胞与免疫细胞之间还存在信号反馈机制，并且通过多个信号通路调节免疫细胞的增殖、凋亡和免疫功能。

1.3 炎症反应与成骨细胞生成 在炎症反应过程中，T淋巴细胞与巨噬细胞释放一系列炎症因子对局部成骨环境产生深刻影响。在炎性细胞因子如TNF-α和IL-1的存在下，NF-кB信号通路的激活，成骨细胞在骨创伤炎症早期生成[20],然而NF-кB信号通路的持续激活进一步可以导致MSC凋亡增加，以及成骨细胞的凋亡增多[19]。IL-4、IL-13等炎性因子则可以增强成骨细胞的细胞迁移[21]，并通过STAT信号通路调节成骨细胞内相关蛋白的表达，抑制炎症反应发生并减少骨吸收。反之，文献报道IL-10和IFNγ在体内体外实验以及临床观察中干预间充质干细胞向成骨细胞分化[22]。

骨修复过程显然需要稳定的免疫系统支持。文献报道在骨愈合初期，严密调控下的初始免疫应答虽然短暂，但可以级联式的引发骨修复过程[23]。然而也有研究团队报道了免疫反应对骨愈合过程的负面影响[24]。免疫调控十分精密而复杂，TNF-α缺失会引起骨的延迟愈合，然而长时间过表达TNF-α则引起骨破坏[23]。因此相同免疫反应既可以促进骨愈合，也可以导致骨愈合障碍。

因此笔者认为骨创伤发生后，炎症反应是一种组织损伤的保护机制，应当为后期修复和愈合的基础。因此炎症反应应当具有较短的周期并且可以引发进一步的愈合机制。反之，如果炎症反应迁延或过强，会对组织造成损伤。脉管系统在这些炎症反应中扮演重要角色，尤其是急慢性炎症中各阶段均有毛细系统参与，佐证了脉管系统对炎症的支持作用。血管生成作用也从一个侧面反应炎症的病程。如风湿性关节炎病灶组织中，炎症的病程常伴有血管大量生成。这种血管的过度生成往往表明骨愈合减缓。

在骨愈合初期，血流量与创伤前比较具有大幅减少。血流量在骨愈合过程中逐步提高，最终可以超过创伤发生前水平。在骨愈合过程中组织缺氧信号广泛影响血管的生理或病理再生，其中缺氧转录因子(HIFs) 起到了介导血管生成的核心作用。有较多研究揭示HIF信号通路与其下游靶点血管内皮生长因子(VEGF)在骨修复和软骨修复中起到重要调节作用[25]。在动物模型和临床实验中通过对该信号通路的药物干预，发现血管生成反应与炎症反应一样，需要控制在合理水平以利于组织修复。

2 血管生成与炎症反应信号转导

尽管血管生成研究起步较早，但除血管内皮细胞外，近年来免疫细胞的作用日益受到关注。

2.1 巨噬细胞系介导的炎症反应与血管化 巨噬细胞参与多种类型的免疫反应，是炎性血管化和血管改建的细胞枢纽。局部组织的巨噬细胞与循环血中的巨噬细胞在局部缺血模型中可刺激动脉形成因而有助于增加血管系统生成[26]。众多分泌性产物与这一过程相关，如血管内皮生长因子(VEGF)[27]，胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板源性生长因子(PDGF)、TGFα/β、成纤维细胞生长因子(bFGF)等，白细胞介素类物质如TNF-α、IL-8、IL-1β等也有研究报道。

巨噬细胞的激活状态可以深刻影响其对血管生成的促进作用。巨噬细胞可以激活为M1、M2巨噬细胞，通过Th1和Th2细胞提呈；M1巨噬细胞也经由经典激活信号分子如TNF-α、IFN-γ、脂多糖(LPS)等促炎因子引发早期急性炎症。相似的，在慢性炎症中M2型巨噬细胞通过IL-4、IL-10和IL-13等炎症抑制因子激活，并且激活反应与血管生成或血管重塑相关[28]。而在肿瘤的血管化过程中，肿瘤巨噬细胞较M2型巨噬细胞有更明显的极化，加速肿瘤血管化过程[29]。组织中血管的生成和重塑有显著的关联性，甚至有假说认为M2型巨噬细胞可以分化为一类具有特定促血管生成作用的细胞亚型[30]。

巨噬细胞在IL-4与IL-13的作用下可以分化为M2a，或在免疫复合体与TLR/IL-1R拮抗剂的作用下分化为M2b[31]。然而仅有被IL-10诱导产生的M2c型细胞具有较强的促血管生成作用，与此同时抑制炎症反应并增加细胞外基质的沉积和重塑[32]。还有研究暗示M1、M2a以及M2c巨噬细胞在促进血管生成方面均具有重要作用并且作用各不相同[33]。M1型巨噬细胞可潜在分泌如VEGF等的血管生成因子，而M2a细胞分泌了血小板源性生长因子(PDGF)将外膜细胞募集至局部，M2c则释放金属蛋白酶9(MMP9)参与血管的重塑过程[33]。

2.2 非巨噬细胞参与的炎性血管生成 其他免疫细胞，如树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞等均可能在血管生成与改建的过程中参与。抗炎因子如骨化三醇或前列腺素E可以激活树突状细胞分泌大量VEGF以及少量成纤维细胞生长因子[34]。此外肥大细胞也可以潜在分泌VEGF、PDGF、bFGF等[35]。近年来发现，中性粒细胞在缺血组织中表达MMP-9，从而增强VEGF的血管生成效应[32]。通过在肿瘤模型领域的研究，有团队报道了T细胞可直接参与血管再生过程，加速血管形成。出现血管损伤或缺氧的局部通过表达CCL28等可富集大量T细胞，进而提高局部VEGF水平。通过免疫耗竭方式减少局部CD25、CD4双阳性细胞可以显著抑制局部VEGF水平，减少血管生长速度[36]。另外学者观察自然杀伤细胞的数量与动脉生成有关。自然杀伤细胞在血管生成过程中的作用报道较少，可能机制为释放IFN-γ促使T细胞分化[37]。体外实验证实VEGF可以促进T细胞的转化，且T细胞通过与单核细胞的直接接触和旁分泌方式导致单核细胞转变为炎症状态[38]。

3 炎症反应在血管生成与骨修复中的意义

骨愈合过程中，均需要经历炎症反应与血管生成过程。炎症反应与血管生成不仅是骨愈合的关键过程，而且在发生过程上受到精密调控。如果炎症反应和血管生成过程受到干扰，将导致骨愈合减缓或障碍。

3.1 血肿形成阶段的调控 在骨损伤发生后，由于血管功能异常，局部形成血肿。在血肿结构中，多种细胞类型共存，这与血液中的细胞类型相一致。血肿组织暂时填充了骨创伤的缺损部位，与骨组织断端、骨髓腔、骨膜、内皮和肌肉相接触，这一环境给予了进一步骨修复的空间。血肿初期常见到细胞比例的快速变化，主要是由于有核细胞，尤其是中性粒细胞的寿命较短。在绵羊骨损伤模型[23]中，该观点已经得到证实。血肿组织内的细胞组分持续发生变化，细胞毒性T细胞数量在正常愈合过程中持续下降，辅助T细胞比例上升。与此过程相伴有多重细胞因子的表达，主要是在造模后24～36 h表达抗炎性因子如IL-10和TGF-β。炎症反应下调的同时，血管生成相关的细胞因子同期开始表达，较有代表性的是HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)[23]。这一过程暗示血管生成和炎症反应在特定阶段可以具有相互依存关系。

骨膜是血管新生的重要起源，在骨损伤60 h后，骨膜中HIF-1α、PDGF、和血管内皮细胞标记物CD34等表达上调，与炎症信号的回落相呼应。在骨修复中尤其是血管重建后与软骨成骨发生过程中，髓细胞因子(SDF-1)在骨膜间充质干细胞与内皮细胞间均有表达，其表达水平亦与局部缺氧相关，其表达后不仅加速血管生成，且在骨膜组织中兼具有富集间充质干细胞和加快软骨内成骨的作用[1]。SDF-1主要功能是与下游受体CXCR4结合，并激活JAK/STAT、PI3K/Akt 和ERK1/2等多条信号通路,广泛调节效应细胞的增殖与迁移。总之骨愈合过程和血管生成通过炎症反应引发，随后炎症水平的逐步下降又是血管生成反应乃至骨修复的启动因素。

3.2 炎症反应失调推迟血管生成 在炎症反应失调模型中，延长了炎症过程并观察到血管生成发育明显滞后。在炎症反应延长模型中，第21天时血管假性血友病因子(vWF)在模型组骨膜中表达依然较少，而在血肿组织中血管生成相关因子包括VEGF、vWF、PDGF等均表达较少[39]。而对比正常组可以发现，正常组由于血供恢复快，因此伤后7 d可见HIF-1α表达显著减少[23]，标志着局部供氧水平提高，血管已经再生改善局部血运。在正常组中，组织学观察能在7 d左右见到血管形成。长期实验观察到血管生成速度以及骨愈合速度在炎症反应失调动物中明显减慢。

上述研究结果通过动物模型系统分析了炎症反应在引发血管生成和进一步骨愈合的重要性。尤其是在伤后60 h局部愈合过程已经完全开始。然而临床环境下骨创伤发生后需要等待较长时间接受手术，术中又往往切除血肿部分，从而损失了早期愈合过程中积累的细胞与生长因子。术后产生的新血肿和周围组织又将处于不同的阶段，从而导致骨组织愈合过程的紊乱。因此在现阶段手术中如何能保存血肿组织或保存细胞环境乃是外科技术的发展方向。

4 总结与展望

骨外科领域已经广泛认识到骨创伤后血管再通的重要性，可以增加骨愈合和重建的成功率。然而骨愈合过程中免疫系统的作用价值仍然常被忽视。国内相关研究报道尚少，有多位学者通过文献报道形式关注了这一研究方向[40,41]。在动物研究实验方面，张灵芝等[42]对大鼠牙槽骨组织中的炎症反应进行了研究，并观察到过强的炎症反应使拔牙后损伤的牙槽骨组织高度下降，牙槽骨组织的损伤恢复减慢。免疫细胞与免疫信号与血管化之间具有直接而紧密的联系，进一步调控骨修复中的炎症反应将有助于骨愈合过程。过强的免疫反应或是失调的血管生成反应均将导致骨重建失败。三大系统之间的平衡与分阶段调控将成为骨修复领域的重要研究方向与治疗手段。

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[收稿2016-01-13 修回2016-03-23]

(编辑 倪 鹏)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.028

①本文受国家自然科学基金项目(No.81573997)、江苏省高校自然科学研究面上项目(No.15KJD360001)和江苏省高校研究生创新计划项目(No.KYZZ16-0409) 资助。

袁 翰(1988年-)，男，主要从事骨组织工程和骨创伤修复方面研究，E-mail:hanyuan@njucm.edu.cn。

及指导教师：黄桂成(1958年-)，男，教授,主任医师,博士生导师,南京中医药大学副校长，主要从事脊柱病和脊髓损伤与修复方面研究，E-mail:hgc@njucm.edu.cn。

R363.2

A

1000-484X(2016)12-1850-05