一种猪氟烷基因的分子检测方法

陈金洁杨云华戴玉娇

（1.潼南区玉溪镇畜牧兽医站，重庆 402660；2.潼南区农业委员会，重庆 402660）

一种猪氟烷基因的分子检测方法

陈金洁1杨云华1戴玉娇2

（1.潼南区玉溪镇畜牧兽医站，重庆 402660；2.潼南区农业委员会，重庆 402660）

猪应激综合征（PSS，又称猪恶性高温综合征）是由常染色体上单隐性基因控制的一种遗传疾病，控制猪应激综合征的基因又称为氟烷基因。氟烷基因广泛存在于外来猪种和外来猪种与地方品种杂交而育成的品种品系。氟烷基因纯合子造成肉质下降，产生PSE肉。近年来，各地猪场在努力提高瘦肉率的同时，发现氟烷基因频率在猪群中有升高的趋势，从而给猪场带来了很大的损失。因此，及早地、准确地对猪群进行氟烷基因的检测，尤其是从基因型方面进行诊断已是势在必行。正常猪该基因在两条染色体上都具有Hhal酶切位点，基因型为NN，即有493bp和166bp两条带；氟烷敏感型的猪该基因在两条染色体上都不具有HhaI酶切位点，基因型为nn，即有659bp一条带；携带猪该基因在一条染色体上具有HhaI酶切位点，另一条染色体上不具有HhaI酶切位点，基因型为Nn，即有659bp 、493bp和166bp三条带。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂：Tris饱和酚，分析纯，北京鼎国生物技术发展中心；无水乙醇、三氯甲烷，分析纯，成都金山；蛋白酶K，MMERCK CO，德国。Taq DNA 聚合酶，dNTP，大连宝生物工程有限公司；限制性内切酶HhaI，大连宝生物工程有限公司；琼脂糖、溴酚蓝、二甲苯睛、GODVIEW，DNA Marker，大连宝生物工程有限公司。

试验动物：随机选取重庆某猪场6头100kg左右的育肥猪，品种为杜洛克父本与本地母本杂交的F1商品代。用耳号钳夹取少量耳组织，装入盛70%乙醇的离心管中，-20℃保存备用。

1.2 仪器

离心机、恒温水浴锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统。

1.3 试验方法

1.3.1 技术路线

耳组织DNA的提取→琼脂糖电泳检测→PCR的扩增与检测→酶切消化与酶切产物检测。

1.3.2 检测方法

（1） 猪耳组织基因组DNA的提取

常规酚一氯仿法抽提猪耳组织中的DNA。取约20mg猪耳组织，将组织样剪碎，加入组织提取液600 μl，混匀。加入蛋白酶 K（20 mg/mL）10μl，至终浓度200 μg/ml，50℃～55 ℃消化过夜。等体积苯酚抽提，12000转/min，离心10 min，取上清。等体积苯酚：氯仿（1：1）抽提，12000转/min，离心10min，取上清。等体积氯仿抽提，12000转/min，离心10 min，取上清。2倍体积冰冷的无水乙醇沉淀DNA，12000转/min，离心10 min，弃上清，70%乙醇洗沉淀两次，真空抽干，用适量TE（pH8.0）溶解DNA。0.7%琼脂糖电泳后-20℃保存。

（2）酶切产物检测

待酶切完全后，10000rpm离心lmin，加入2μl溴酚蓝，共17μl，全部加入点样孔，待电泳。酶切产物电泳在2%琼脂糖凝胶上点样，同时点2μLDNAMarker。先在140V电泳约5min，或使指示剂跑出点样孔，再将电压控制在50～60V下，电泳3～4h，在凝胶成像分析系统上观察结果并照相，保存电泳图谱。

2 结果与分析

2.1 组织DNA琼脂糖检测结果

采用 0. 6 %琼脂糖对提取到的DNA进行检测，以 Goldview 作为指示剂，120V 稳压电泳 45 min，凝胶成像系统成像。若在加样孔附近有一较亮条带，其后没有拖尾条带或拖尾条带明显比其他暗淡，则判断基因组没有降解或降解不严重。琼脂糖电泳检测（图1）中显示，亮带明显，不拖尾，说明提取到的DNA效果较好，满足进行后面扩增及酶切反应的要求。

2.2 PCR扩增检测结果

利用上述PCR引物进行PCR扩增产物检测得到如下结果（图2）。所有条带均明显、清晰可见，说明PCR扩增效果良好，再次表明，所提取到的DNA浓度及纯度均满足试验要求，可以进行酶切反应。

2.3 酶切产物检测效果

HhaI酶切产物电泳图谱检测得到如下结果（图3），显示493bp和166bp两条带的电泳槽，即图3中编号为2、3、4、6，其基因型NN，为正常型；显示659bp 、493bp和166bp三条带，即图3中编号1、5，基因型Nn，则为携带者。6只所抽取的猪只中，2只携带者，其余4只为正常型，无氟烷敏感型。

3 讨论

氟烷测定法是目前常用的氟烷基因检测方法，一般临床应用的氟烷浓度为5%，混合氧气法量为1500～2500ml/5min，供测猪吸入氟烷-氧混合气持续时间为3～5min。2～3月龄幼猪吸入混合气1min后如果立即失去知觉，3～4min后表现肌肉痉挛，四肢僵直，则称为氟烷阳性猪，4min后未出现任何症状，四肢松软的称为氟烷阴性猪。此法简单、易操作，但准确性较低，且只能检测出Hhalnn纯合子，无法区分HhalNN纯合子和HhalNn杂合子，也就是说无法净化猪群中的氟烷有害基因。本方法比较于氟烷检测，可以检测出3种基因型而更准确，避免了对被检测猪只的干扰。血液遗传标记选择法是用PHIB连锁基因来诊断氟烷基因型，相比于氟烷测定法准确性较高，但是用其他连锁基因检测的准确性很难预测，导致此法的应用受到很大限制。而DNA探针技术由于程序复杂，操作难度较大，亦不便推广。PCR-SSCR法和PCR-RFLP法虽然准确性高，但由于需要扩增特定的DNA片段，也给检测带来不便。综上所述，本文介绍的方法耗时较短，操作相对简便，并且可以获得良好的检测效果，不失为一种猪氟烷基因检测的优良方法。当然，随着分子生物技术的不断进步和先进检测技术的广泛应用，猪氟烷基因的检测方法也将朝着更简便、快速、准确的方向发展，相信在不久的将来，一定会有更好的氟烷基因检测方法面世。

4 结论

使用本方法进行氟烷基因检测，取得了预期的效果，为猪场在选种提纯提供了重要的依据，对生猪生产具有较大意义，便于及早地进行氟烷基因的检测，即时地淘汰隐性纯合子个体，有效地避免父母代猪群中杂合子公猪与杂合子母猪的交配，并能严格控制后备猪群中氟烷基因的存在，引种时能够做好应激综合征的检测等。另外，由于氟烷基因具有多效性，一方面作为应激反应的主效基因，导致猪的死亡率升高，同时减少窝产仔数，增加劣质肉率；另一方面，对猪的产肉力呈加性效应，可提高瘦肉率。目前，氟烷基因的检测技术已趋完善，正向着更简便快速的方向发展。在生产实践中，掌握了快速准确的氟烷基因检测技术，可以培育抗应激专门化品系为母本，以高瘦肉率的应激品系为父本，建立杂交繁育体系，其F1商品代皆为Nn型个体，这样既可以防止劣质肉、降低应激死亡率，又可以利用Nn个体的杂种优势，提高瘦肉率，生产出优质的商品瘦肉型猪。另外，如果继续试验，对已知基因型的猪群进行杂交，再次检测子代基因型，可以从遗传角度验证这种检测方法的效果。