猪精液冷冻保存影响因素研究进展

张 亮，姜 垠，邱进杰，曾 渝（.重庆市六九原种猪场有限公司，重庆 409000；2.重庆市畜牧科学院，重庆 402460）



猪精液冷冻保存影响因素研究进展

张 亮1，姜 垠1，邱进杰2*，曾 渝1
（1.重庆市六九原种猪场有限公司，重庆 409000；2.重庆市畜牧科学院，重庆 402460）

摘 要：由于猪冻精在经济生产中具有重要意义，其关键技术——猪精液冷冻保存技术已成为研究的热点。本文对猪精液冷冻原理及冷冻损伤进行了说明，并对精液稀释前处理、稀释液及添加剂、冷冻保护剂、冷冻程序与解冻、冷冻剂型等方面的研究进展进行了综述。

关键词：猪；精液；冷冻保存；影响因素

猪人工授精技术已经广泛应用于畜牧业生产，所用精液多为鲜精，与冻精相比，用鲜精配种存在精液保存时间短，活力受运输环境影响大、浪费严重和易交叉感染等问题，使人们的视线逐渐转移到冷冻精液上[1]。猪精液冷冻技术始于20世纪50年代，是指利用干冰、液氮、液氦等作冷源，将猪精液经特殊处理后冷冻，保存在超低温状态下，以达到长期保存的目的。冷冻保存打破了猪精液使用的时空界限，必将加快养猪业的发展，对畜牧业可持续发展和繁荣具有重要作用。猪精子本身对冷应激特别敏感，在冷冻过程中极易损伤，从而造成与配母猪的受胎率低、窝产仔数少等问题，严重制约猪冷冻精液的应用与推广。因此，深入系统地研究猪精液冷冻保存关键技术，探讨影响猪冷冻精液保存影响因素，进一步提高猪冷冻精液质量，已成为国内外养猪生产中急待解决的问题。本文将就猪精液冷冻保存影响因素研究进展进行综述。

1　 猪精液冷冻原理及冷冻损伤

猪精液冷冻技术是指利用干冰(-79℃)、液氮(-196℃)、液氦(-269℃)等作为冷源，将精液进行特殊处理后冷冻，然后保存于超低温状态，使精子细胞的代谢接近完全停止，使精子在生命静止状态下保存下来，达到长期保存的目的，当温度升高后又能恢复活性，且具备受精的能力。

在冷冻过程中，精子细胞会受到冰晶化导致的溶液效应所致损伤(化学性损伤)和冰晶对细胞膜及细胞内部结构产生机械性损害(物理性损伤)[2]。损伤的程度一般由“冷冻—解冻”速率和“冷冻—解冻”温度决定。然而，细胞内形成冰晶是不可避免的，控制所形成冰晶的大小和数量，减少或不形成能够对精子造成物理性损伤的大冰晶，而仅维持在微晶状态，就会减少对精子的损伤。为减少对精子细胞的损伤，学者们进行了大量的研究，并取得了重大的进展。

2　 猪精液冷冻保存的影响因素

2.1稀释前处理

公猪精子在迅速冷却时会失去活力，这种现象发生在精液采集后迅速冷却至15℃、5℃或0℃时，称之为“冷休克”[3]。在所有家畜中，公猪的精子对冷休克最敏感，但精子在室温下用低的稀释倍数稀释，然后缓慢降温或孵育l～5 h后能增强抗冻能力，故大部分精液冷冻程序均包括一个15℃或15℃以上的数小时的冷冻平衡时间。此外，在去除精清的操作上，Carvajal等[4]研究发现高转速短时间离心不会影响精子的恢复和顶体的完整率，因此建议利用高转速短时间离心去除精清。李玉芳等[5]研究结果显示，精清不能完全去除，精清保留量为0 mL/10 mL时解冻精子的存活率和活力要显著低于0.5 mL/10 mL和1 mL/10mL。

2.2稀释液及添加剂

在温度变化过程中，精液对精子的保护能力是有限的。为此，进行精液冷冻保存就要配合使用专用的溶液先将精液进行稀释。对稀释液的基本要求包括pH、缓冲性、渗透压和低温保护性能。一般的稀释剂都由糖类、蛋白质、脂类及其他添加物组成。

徐振军等[6]进行了不同组合的糖类对精子冷冻保存的影响试验，研究结果显示，以葡萄糖-乳糖为基础液组的精子存活率极显著高于以葡萄糖-蔗糖-柠檬酸钠组和葡萄糖-乳糖-柠檬酸钠组，且解冻后精子顶体完整率显著高于另外2组。金一等[7]发现海藻糖对精子冷冻保存是有益的，且能抑制精子内活性氧的发生。胡建宏等[8]发现添加25%的海藻糖可以明显抑制精子获能，且海藻糖只有与甘油共同作用时才能在“冷冻—解冻”过程更加有效地保护精子。此外，有研究表明，在稀释液中添加10 mg/L维生素C 、0.05%可溶性N-乙酰基-D-葡糖胺、类透明质酸、安钠咖、海胆色素、2-丙羟基-β-环式糊精等可提高解冻后精子顶体完整率和质膜完整性，保护精子活力。

为提高猪精液的冷冻效果，许多学者对猪精液的冷冻稀释液及其添加剂进行了大量的探索实验，但是效果一直都不是很理想，还没有找到一个稳定可靠的稀释液及其添加剂配方，有待进一步研究。

2.3冷冻保护剂

冷冻保护剂是指在溶液中可同水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程，使溶液的黏性增加，从而减少冰晶的形成；同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤[9]。在精液冷冻保存过程中，冷冻保护剂对精子的冷冻效果及解冻后精子质量至关重要。

甘油是目前应用较广泛的一种冷冻保护剂，对精子既有保护作用，又有毒害作用。针对添加不同终浓度的甘油对精子活力影响的研究较多，大多结果显示在添加2%～4%时，其解冻后精子活力和顶体完整率较高[10]。但也有研究显示，添加14%的甘油后液氮冷冻，39℃水浴解冻后，猪精子活力仍能达到48%[11]。目前国内外研究者多数使用的是低浓度甘油( < 4% )，而3%甘油是最常用的浓度标准。刘宏等[12]研究比较了不同平衡时间和不同DMF添加量对猪精液冷冻保护效果的影响，研究结果表明，DMF能完全替代甘油，获得较好的冷冻保护效果。此外，针对乙二醇、丙二醇、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基亚砜(DMSO)等冷冻保护剂的研究也较多[13]。

2.4冷冻程序与解冻

猪精液冷冻的冷源主要以液氮为主，从精液的采集至最终保存，其温度变化范围在230℃左右，在冷冻过程中，温度的变化对精子的影响比较大，主要表现为，解冻后精子活力丧失，精子膜的选择通透性降低、顶体膜损伤等。精液“冷冻—解冻”时，使精子快速越过－5～-25℃这一高危险温区是提高精子冷冻后存活率和品质的一个重要手段[14]。

冷冻速率对猪精液的冷冻至关重要，在冷冻精液制作过程中必须提高冷冻速度，温度须持续下降，不能出现回升现象。精液在冷冻过程中应快速通过危险温区(0～－60℃)，这样才能提高冻精解冻后的活率。以15℃为分界线，先将精液在室温(22℃)下等温稀释并在1 h内降温至15℃，维持3～4h后再利用l h时间从15℃缓慢降温至5℃并平衡2 h，然后用含冷冻保护剂的第二液等温稀释并分装冷冻，这样可将精子的冷休克损伤降为最低。

解冻同冷冻一样重要，目前常用的解冻液有Glucose-EDTA解冻液与DPBS-BSA解冻液。同时，适当的解冻温度能使冷冻精子快速越过危险温区，使玻璃化快速越过结晶态直接变为液态，降低对精子的伤害。Watson[15]认为精液解冻温度与动物品种及精子对“冷冻—解冻”温度骤变的敏感性有关，但多数学者倾向于采用37℃解冻。郑筱峰等[16]研究表明，37℃水浴30s解冻法优于室温20 s后再于37℃水浴10s解冻法，前者的精子运动度、质膜完整率、顶体完整率和体外受精胚胎发育率均显著高于后者，且前者在体外授精胚胎发育率方面与新鲜精液对照组无统计学差异。Marta等[17]研究结果显示，甘油浓度和解冻速率均显著影响解冻后精子的所测质量参数(P< 0.05)；3%的甘油或者解冻速率为l 800℃/min时解冻后的精子质量最高(P < 0.05)，经2×2因子设计分析结果表明，二者的组合效应所得的解冻后精子质量亦最高。

目前研究证明，经37℃、30s水浴解冻方法更适合0.25mL细管猪冻精的解冻；而颗粒冻精解冻适用干解法：40～45℃、8～10s即可使精子的平均活率达到最高。

2.5冷冻剂型

精液冷冻保存的形式有主要有：安瓿、颗粒、铝箔(塑料)袋和细(麦)管法。细管法是新近发展出来的冷冻方法，采用细管法便于保存，也有助于提高精液的利用率，包括5 mL大管、0.5 mL细管和0.25 mL细管。所有这些保存类型既有其优点，亦有其缺点。

颗粒和0.25 mL、0.5 mL小型细管拥有较大的表面积容量比使其更适合低温冷冻保存，然而颗粒法的冷冻精液在来源及头份的区别上存在困难，不易解冻且容易造成交叉污染；细管法冷冻的猪精液解冻后精子存活率略低于颗粒法，受胎率却比颗粒法高，但是1头份一般需要解冻10～20根小型细管或2～3根扁平细管，这成为推广应用的主要障碍；5 mL的大型细管具有1头份的精子数量，但其表面积容量比小，难以实现理想的冷冻和解冻过程[18]。塑料袋包装的试验结果表明，它可以均匀地冷冻和解冻，解冻后精子存活率也高，并含有l头份精子数量，单个扁平袋子和多重扁平袋子(分别为54%和49% )中冷冻的精子质膜完整率显著地高于0.5 mL塑料细管(38% )中冷冻的精子(P< 0.05)，解冻后多重扁平袋子比0.5 mL塑料细管每剂量中存在更多活精子，但其面积太大，不适合放置在液氮罐里保存，因此尚未应用于商业生产[19]。

由于公猪射精液量较大，一般0.25 mL、0.5 mL麦管很难满足要求。通过努力，近年来5 mL大管冷冻猪精液也获得成功，为进一步进行猪冷冻精液应用奠定了基础。塑料细管的大小和质地对精液的保存也十分重要，要求管径细、壁薄，便于传热，适于快速冷冻。容量最好是一次授精的剂量，精子密度大可用容量小些的细管。

3　存在的问题及展望

半个世纪以来，研究人员对猪精液冷冻技术进行了大量研究，包括稀释前的处理、稀释液的组成和添加剂、冷冻保护剂及浓度、降温速率和降温条件、解冻液组成及解冻程序等。尽管随着冷冻稀释液及保护剂配方的改进和研发，猪冷冻精液在各方面的质量都有所提高，但其实际使用效果与鲜精仍有很大的差距，主要表现在以冻精进行人工授精得不到与液态鲜精相当的产仔数而难以推广应用。究其原因，主要有：在理论上，猪精液冷冻过程中的“冷冻—解冻”机理、精子损伤机理、在“冷冻—解冻”过程中外部环境变化对精子的影响、精子内部组成物质的变化规律及分子机制等诸多方面尚不完全清楚；在实际操作中，“冷冻—解冻”程序和稀释液、解冻液的组成不一致，甚至差别较大；在生产上，存在着输精剂量和方法不同、操作程序相对复杂等原因[1]。

随着分子生物学技术的发展，从分子生物学层面探索冷冻损伤的原理以及温度、渗透压、氧化应激反应等对精子顶体、质膜及DNA损伤的机制，探究精液冷冻过程中各个阶段精子细胞内外的变化成为了可能。相信不久的将来，随着对影响精子冷冻相关因素的深入研究，一定能够攻克猪精液冷冻保存中存在的技术难题。

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(收稿日期：2015-08-31)

*通讯作者：邱进杰，E-mail：429482286@qq.com

作者简介：张亮（1990-），男，重庆开县人，硕士，E-mail：zhangliang215@163.com