仿生油菜蜂花粉化学成分研究

杨茂森王 鑫张世文刘占莉（甘肃耐克特蜂产品有限公司，天水740；甘肃省养蜂研究所，天水740）

仿生油菜蜂花粉化学成分研究

杨茂森1王 鑫1张世文2刘占莉2
（1甘肃耐克特蜂产品有限公司，天水741022；2甘肃省养蜂研究所，天水741022）

采用柱色谱分离纯化技术，从仿生油菜蜂花粉经微波提取后的乙醇提取物中分离纯化鉴定出12个化合物。经UV，IR，MS和NMR鉴定为豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitost-erol）、胡萝卜苷（daucosterol）、十六烷酸（palmitic acid）、癸烷（decane）、亚油酸（linoeic acid）、芦丁（Rutin）、槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖（2-1）-β-D-葡萄糖苷（kaemferol-3-O-β-D-glucosyl-（2-1）-β-D-glucoside）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2→1）-β-D-葡萄糖苷/quercetin-3-O-β-D-glucosyl-（2-1）-β-D-glucoside。其中从仿生油菜蜂花粉分离鉴定出的各化合物与从油菜蜂花粉中分离得到的基本相同。

仿生油菜花粉；黄酮；化学成分

油菜（Brassica campestris L）的花粉有一定抗氧及抗良性前列腺增生的药效［1］。所含化学成分比较复杂，研究表明目前已发现的化合物主要集中在黄酮、甾醇、脂肪酸及其衍生物等几类主要的物质上［2-5］。为了探究天然油菜花粉与仿生花粉可能的药效活性成分及差别，本研究将仿生油菜花粉经乙醇微波提取后得到乙醇提取物，取乙醇提取物的石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部位及正丁醇萃取部位，利用多种柱色谱及波谱技术共分离鉴定了豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（βsitosterol）、胡萝卜苷（daucosterol）、十六烷酸（palmitic acid）、癸烷（decane）、亚油酸（linoeic acid）、芦丁（Rutin）、槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖（2—1）-β-D-葡萄糖苷（kaemferol-3-O-β-D-glucosyl-（2→1）-β-D-glucoside）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2→1）-β-D-葡萄糖苷/quercetin-3-O-β-D-glucosyl-（2→1）-β-D-glucoside。其中分离鉴定出的各化合物与从油菜花粉中分离得到的基本相同。

1　仪器与材料

熔点仪：X-4型显微熔点测定仪（温度计未校正）；红外光谱仪：NEXUS 670型傅立叶变换红外光谱仪（KBr压片，德国Bruke公司）；紫外光谱仪：UV-2001型紫外光谱仪（日本日立公司）；核磁共振仪：INOVA-400型核磁共振波谱仪（美国Varian公司），TMS为内标物；质谱仪：LCQ Deca XP plus ESI-MS/MS质谱仪，ZHBHS质谱仪EI-MS；柱层析硅胶：200-300目和160-200目，青岛海洋化工厂；薄层层析硅胶：H60、GF254，青岛海洋化工厂；显色剂：20%的硫酸乙醇溶液，碘蒸气；试剂：工业试剂重蒸。

油菜Brassica campestris L．花粉由甘肃耐克特蜂产品有限公司采集，并通过兰州大学药学院马志刚教授鉴定。

仿生油菜蜂花粉的制备：油菜蜂花粉精选除杂，经臭氧杀菌灭菌后，按蜂花粉重量的15～30%喷洒生理盐水，搅拌均匀后在温度为28～38℃条件下培养48～50 h，完成脱敏处理。再按每份1 kg均匀喷洒200～300 ml蜂巢花粉培养液，在温度为28～35℃条件下培养48～50 h，再按每份1 kg均匀喷洒200～300 ml酵母菌液，在温度为28～35℃条件下培养48～50 h，按每千克均匀喷洒200～300 ml乳酸菌液，在温度为28～35℃条件下培养60～72 h，完成生物发酵。用60目的纱网制成小颗粒后，进行真空度为-0.009 MPa，温度-55～-65℃真空冻干，使花粉中含水量在3～5%即可。并置于臭氧灭菌罐中灭菌50分钟，即制备出冻干活性仿生蜂花粉。

2　方法与结果

2．1提取分离

将仿生油菜蜂花粉2.5 kg以70%乙醇渗漉提取，减压浓缩，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取多次，减压蒸干，取其中所得石油醚萃取物（78 g）、乙酸乙酯萃取物（100.04 g）和正丁醇萃取物（186.01 g）继续试验。将石油醚萃取物上硅胶柱，依次以石油醚（100%～0%）∶乙酸乙酯（0%～100%）梯度冲柱，得流份la～8a。流份2a上硅胶柱除杂，经制备薄层色谱［展开剂：石油醚∶乙酸乙酯（3∶2）］得化合物1（120 mg），流份4a上硅胶柱除杂，经制备薄层色谱［展开剂：石油醚∶乙酸乙酯（1∶1）］得化合物2（60 mg），流份5a上硅胶柱除杂，经制备薄层色谱［展开剂：石油醚∶乙酸乙酯（3∶7）］得化合物3（30 mg），流份7a上硅胶柱除杂，经制备薄层色谱［展开剂：石油醚∶乙酸乙酯（1∶3）］得化合物4（120 mg），流份8a上硅胶柱除杂，经制备薄层色谱［展开剂：石油醚∶乙酸乙酯（1∶8）］得化合物5（34 mg）。

将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱，依次以乙酸乙酯及10%、30%、50%、70%、100%甲醇梯度洗脱，得不同浓度甲醇洗脱组分。用甲醇洗脱，得流份lb～6b。流份2b上硅胶柱除杂，经制备薄层色谱［展开剂：氯仿∶乙酸乙酯（3∶2）］得化合物6（70 mg）；流份3b经制备薄层色谱［展开剂：氯仿∶甲醇（1∶1）］得化合物7（87 mg）；流份4b经制备薄层色谱［展开剂：氯仿∶甲醇（15∶1）］得化合物8（73 mg）；流份5b经制备薄层色谱［展开剂：石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇（2∶1∶2）］得化合物8（60 mg）。

将正丁醇萃取物按上法操作，得不同浓度甲醇洗脱组分。将50%甲醇洗脱组分上硅胶柱，用甲醇-水洗脱，按份收集，合并得流份1c～5c，流份1c经制备薄层色谱［展开剂：氯仿∶甲醇（1∶1）］及制备型液相色谱（40%甲醇洗脱）制得化合物9（23 mg）；流份2c经制备薄层色谱［展开剂：氯仿∶甲醇（2∶1）］及制备型液相色谱（50%甲醇洗脱）得化合物10（19 mg），经制备薄层色谱［展开剂：氯仿∶甲醇（4∶1）］得化合物11（123 mg）。将70%甲醇洗脱组分上硅胶柱色谱，以氯仿∶甲醇（12∶1）洗脱，得化合物12（82 mg）及流份1d～4d，流份1d经制备薄层色谱［展开剂：氯仿∶甲醇（10∶1）］得化合物13（22 mg），流份3d经制备薄层色谱［展开剂：氯仿∶甲醇（5∶1）］及制备型液相色谱（45%甲醇洗脱）得化合物14（32 mg）。

2.2结构鉴定

化合物1：无色片状晶体（石油醚-乙酸乙酯），m.p.：147～149℃，H2SO4显紫红色。红外光谱IR（KBr）cm-1：3400.2（-OH），2950.6，1641.7，1375.5，1063.3，812.2。EIMS m/z：412［M］+，394［M+-H2O］，253，229，171，157。其IR，MS，1H-NMR谱与豆甾醇文献［6-7］一致，与对照品混合熔点不下降，化合物1被鉴定为豆甾醇（stigmasterol）。

化合物2：无色针状晶体（石油醚-乙酸乙酯），m.p.：138～140℃，TLC遇H2SO4乙醇显紫红色。红外光谱IR （KBr）cm-1：3419.1（-OH），2951.5，2920.3，1070.1，802.2。EI-MSm/z：414［M］+，396［M-H2O］+，314，255，231，213，159，107。其中IR，MS，1H NMR，13C NMR谱与β-谷甾醇文献［7］一致，TLC做对照，Rf值及色斑相同，并与对照品混合熔点不下降，化合物2被鉴定为β-谷甾醇 （β-sitosterol）。

化合物3：白色颗粒状（甲醇），m.p.：288～290℃，H2SO4显紫红色。红外光谱IR（KBr）cm-1：3410.6（-OH），2938.6，2875.4，1630.2，1460.1，1375.3，1071.2，1024.1，800.3。FAB-MS m/z：576［M］+，414［M+-Glc］。13C-NMR（DMSO-d6）δppm：37.3，29.7，77.4，40.5，140.9，121.6，31.8，31.9，50.1，36.7，21.1，38.8，42.3，56.6，24.3，28.3，55.9，12.1，19.6，35.9，19. 1，33.8，25.9，45.6，29.2，19.4，20.2，23.1，12.3，101.3，70.6，77.2，73.9，77.3，61.6。其IR，MS，1H NMR，13C NMR谱与胡萝卜苷（daucosterol）文献一致；化合物3 50 mg，溶于50 ml 50%甲醇，加入适量盐酸，水浴回流至水解完全。过滤，苷元鉴定为β-谷甾醇（β-sitosterol）；水溶液浓缩后作纸层析检查，与D-glucopyranose TLC做对照，Rf值及色斑相同，化合物3与对照品混合，熔点不下降，化合物3被鉴定为胡萝卜苷（daucosterol）。

化合物4：白色鳞片状固体（氯仿-甲醇），m.p.：63～64℃，红外光谱IR（KBr）cm-1：3038.6（缔合 OH），2916.7，2851.6，1706.7（C=O），1463.4，1299.7，940.4。EIMS m/z：256［M］+，227，211，60，45；1H NMR（CDCl3）δppm：5.12（1H，s，OH），2.33（2H，d，J=7.6Hz，CH2-COOH），1.62（2H，m，J=7.2Hz，CH2），1.29（24H，m，12×CH2），0.85（3H，m，CH3）。13C NMR（CDCl3）谱有一羰基碳δ179.6，其它碳化学位移分别为：34.0，31.9，29.7，29.6，29.6，29.4，29.3，29.2，29.0，24.7，22.6，14.0。其 IR，1HNMR，13C NMR数据与十六烷酸的文献值［8］一致。化合物4被鉴定为十六烷酸（palmitic acid）。

化合物5：白色鳞片状固体或无色液体（氯仿-甲醇），红外光谱IR（KBr）cm-1：2954.5，2923.6，2854.2，1463.0，1377.7，728.6，720.8。1HNMR（CDCl3）δppm：0.88 （6H，t，2×CH3），1.25（16H，s，8×CH2）。13C NMR（CDCl3）δ14.1，22.7，29.3，29.6，29.7，31.9。其IR，1HNMR，13C NMR数据与癸烷（decane）的文献值［8］一致。化合物5被鉴定为癸烷（decane）。

化合物6：棕黄色的油状液体，红外光谱IR（KBr）cm-1：3418.8，3010.6，2906.3，2856.3，1710.3（C=O），1466.4，1377.2，1179.9，1035.6，723.4。EI-MS m/z：280［M］+；1H NMR（CDCl3）δppm：5.34（1H，dd，-CH=CH），2.31（2H，dd，-CH2COOH），2.03（2H，m，-CH2），1.66（3H，t，CH3）。13C NMR （CDCl3）δppm：179.2，34.0，24.7，29.0，29.0，31.8，29.7，27.1，127.9，129.9，25.5，129.6，127.8，27.1，29.2，31.4，22.6，14.0。其IR，1HNMR，13C NMR数据与亚油酸（linoeic acid）的文献值［10］一致。化合物6被鉴定为亚油酸（linoeic acid）。

化合物7：淡黄色粉末，测得m.p.：176～178℃，UV-vis（MeOH，λmax）257，358nm；LC-MS（ESI+），［MC5H8O4-OH-Glc］+at m/z297.8，1H-NMR（400 MHz，DMSO6），δ6.21（d，1H，J=2Hz，C6-H），6.40（d，1H，J=2Hz，C8-H），7.55（d，1H，J=2.1Hz，C2′-H），6.86（d，1H，J=9Hz，C5′-H），7.56（dd，1H，J=9，2.1，C6′-H），9.71（s，1H，C4′-OH），9.21（s，1H，C3′-OH），12.62（s，1H，C5-OH），10.86（s，1H，C7-OH），5.35（d，1H，J=7.4Hz，H1-G），5.12（（d，1H，J= 1.9Hz，H1-R），1.00 （d，3H，J=6.1，CH3-R）；13C-NMR （100MHz，DMSO6）δ156.90（C2），133.80（C3），177.85（C4），157.07（C5），99.13（C6），164.52（C7），94.04（C8），161.70（C9），104.46（C10），122.06（C1′），115.70（C5′），145.22（C3′），148.87 （C4′），116.75（C5′），121.67（C6′），101.20（C1-G），74.55（C2-G），76.95（C3-G），72.34（C4-G），76.40（C5-G），67.47（C6-G），101.67（C1-R），70.49（C2-R），70.84（C3-R），71.05（C4-R），68.69（C5-R），18.18（C6-R）［R and G represent signals from rhamnose and glucose moieties，respectively］。其 UV，1HNMR，13C NMR，MS数据与芦丁的文献值［8］一致。化合物7被鉴定为芦丁（Rutin）。

化合物8：黄色晶体（乙酸乙酯），m.p.：310～312℃，LC遇硫酸乙醇显黄色IR（KBr）：3462，3375，3292，3080，1672，1614，1549，1551，1462cm-1，1H-NMR（400MHz，CDCl3），δ：12.47（1H，s，OH-8），10.76（1H，s，OH-8），9.57（1H，s，OH-3），9.35（1H，s，OH-3），9.29（1H，s，OH-4），7.66（1H，d，J=2.2Hz，H-2），7.52（1H，d，J=2.2Hz，H-6），6.85（1H，d，J=8.8Hz，H-5），6.39（1H，d，J=2.2Hz，H-8），6.18（1H，d，J=2.0Hz，H-6）；13C-NMR（100MHz，CDCl3）δ：147.3，136.6，176.3，161.7，99.0，165.1，94.4，157.9，104. 5，123.5，115.5，145.8，116.0，121.3。IR，1H-NMR，13CNMR光谱数据与文献值［8］一致，故化合物8被鉴定为槲皮素（quercetin）。

化合物9：淡黄色颗粒晶体（乙酸乙酯），m.p.：246～248℃，TLC遇硫酸乙醇显黄色。IR（KBr）cm-1ν：3459，3372，3287，3075，1668，1609，1543，1547。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：6.17（IH，d，J=2.0 Hz，H-6），6.42（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），为A环质子信号，其偶合常数表明为间位偶合；δ 6.65（IH，SH-3）是典型的黄酮3位质子吸收峰δ7.37（IH，d，J=2.0Hz，H-2），6.87（IH，d，J=8.4 Hz，H-5），7.39 （IH，d，J=2.0 Hz，H-6）为B环质子信号，其偶合常数表明B环为1，3，4一三取代形式。其波谱数据与文献［11］报道的木樨草素的基本一致，故化合物9被鉴定为木樨草（luteolin）。

化合物10：黄色粉末，25%硫酸乙醇显亮黄色，m. p.：280～282℃。ESI-MS（m/z）：285.1［M-H］+。1H-NMR （400 MHz，CD3OD）δ：6.21（1H，d，J=1.6 Hz，H-6），6.44 （1H，br s，H-8），6.92（2H，d，J=8.0 Hz，H-3'，H-5'），8.23 （2H，d，J=7.6 Hz，H-2'，H-6'）。以上数据结合文献［8］，故化合物10被鉴定为山奈酚。

化合物11：黄色粉末，25%硫酸乙醇显亮黄色，m. p.：222～224℃。ESI-MS（m/z）：633.0［M+Na］+，609.2［MH］+。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：8.0 1（2H，d，J=8.34 Hz，H-2'，H-6'），6.93（2H，d，J=8.34 Hz，H-3'，H-5'），6.44（1H，br s，H-8），6.23（1H，br s，H-6），5.21（1H，d，J= 7.12 Hz，H-l''），4.76（1H，d，J=7.22 Hz，H-1'''）；13C-NMR （100 MHz，CD3OD）δ：158.65（C-2），135.02（C-3），179.65 （C-4），161.63（C-5），100.23（C-6），166.23（C-7），94.93（C-8），158.66（C-9），105.78（C-10），122.67（C-1'），13243（C-2'，6'），116.46（C-3'，5'），159.54（C-4'），94.93（C-1''），82.91 （C-2''），77.74（C-3''），71.68（C-4''），78.13（C-5''），62.56 （C-6''），105.41（C-1'''），75.77（C-2'''），77.78（C-3'''），71.23（C-4'''），78.56（C-5'''），62.34（C-6'''）。以上数据与文献［12］报道的化合物山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖（2—1）-β-D-葡萄糖苷数据一致。

化合物12：黄色粉末，25%硫酸乙醇显亮黄色，（+）ESI-MS m/z 649［M+Na］+，（-）ESI-MS m/z 625［M-H］-。从1H-NMR谱中显示共有5个芳香质子，其中1对间位偶合质子66.47（1H，s，H-8），6.23（1H，s，H-6），I组ABX偶合系统 δ7.61（1H，d，J=8.45 Hz，H-6'），7.56（1H，s，H-2，），6.86（1H，d，J=8.45 Hz，H-5'），C环质子信号消失，结合13C-NMR谱（δ 133.12，C-3）可知3位被氧取代，以上表明分子中存在槲皮素黄酮母核。1H-NMR谱中还显示2个糖端质子信号：δ 5.69（1H，d，J=7.45 Hz，H-1''），4.62（1H，d，J=7.45 Hz，H-1''）。13C-NMR显示含有27个碳信号，其中2个葡萄糖原子信号103.93（C-1''），98.10（C-1''），82.73（C-2''），77.65（C-3'''，C-5'''），76.76（C-5''），76.65（C-3''），74.54（C-2'''），69.45（C-4''，4'''），60.67（C-6''），60.76（C-6''），再根据糖端基氢的偶合常数可确定2个葡萄糖都为β型。化合物12的1HNMR和13C-NMR数据与文献［13］报道的数据基本一致，故可确定化合物12为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2—1）-β-D-葡萄糖苷。

3结语

本研究运用多种柱色谱技术对仿生油菜花粉的化学成分作了初步研究，共分离鉴定了14种化合物，鉴定了12种化合物，包括6种黄酮、两种脂肪酸类物质、3种萜类及一个烷烃。其中仿生油菜花粉分离鉴定出的各化合物与从油菜花粉中分离得到的基本相同。鉴于黄酮及不饱和脂肪酸类物质都是重要的活性成分，这些化合物不仅丰富了仿生油菜花粉的化学成分研究，还提示探寻仿生油菜花粉中的药效物质可围绕这两类物质展开而研发。

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Study on Chemical Constituents of Pollen of the Bionic Brassica campestris L

Yang Maosen1，Wang Xin1，Zhang Shiwen2，Liu Zhanli2
（1 Gansu Nectar Bee product Co.，Ltd，Tianshui 741022，Gansu；2 Gansu Apicultural Research Institute，Tianshui 741022，Gansu）

Column chromatography were used for the isolation and purification of the chemical constituents of ethanol extract of the pollen of the bionic Brassica campestris L.after extraction by microwave．Twelve compounds were identified by means of UV，IR，MS and NMR spectroscopy as：stigmasterol，β-sitosterol，daucosterol，palmitic acid，decane，linoeic acid，Rutin，quercetin，luteolin，kaempferol，kaemferol-3-O-β-D-glucosyl-（2-1）-β-D-glucoside，quercetin-3-O-β-D-glucosyl-（2-1）-β-D-glucoside．

Brassica campestris L；pollen；flavonoid；chemical constituents